Seeria lahjenduse kalkulaator - Labori kontsentratsiooni tööriist

Jadalahjenduse kalkulaator leiab aine kontsentratsiooni lahjendusseeria igal etapil. Jadalahjendus on laboritehnika, mille käigus vähendatakse lahuse kontsentratsiooni võrdsete sammude seeriana, nii et iga uus etapp lahjendab eelmist sama teguri võrra.

Mis on jadalahjendus?

Jadalahjendus lahendab levinud laboriprobleemi: proov on liiga kontsentreeritud, et seda otse mõõta või kasutada. Selle asemel et püüda ühe sammuga mõõta väga väikest ja suure veaohtlikkusega ruumala, lahjendab teadlane proovi mitu korda järjest, kasutades igal etapil väikest ja hõlpsasti käsitsetavat ruumala.

Iga lahjendus algab eelmise etapi tulemusest, mitte algsest proovist. Nii moodustub kontsentratsioonide seeria, mis väheneb iga kord sama teguri võrra. Seda tehnikat kasutatakse bakterite loendamiseks, ravimi toime testimiseks rakkudele eri annuste korral, laborianalüüside kalibreerimiskõverate koostamiseks ja DNA-proovide ettevalmistamiseks PCR-i jaoks.

Jadalahjenduse valem

Iga lahjendusetapp järgib seda valemit:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ on kontsentratsioon enne etappi
• DF on lahjendustegur
• C₂ on kontsentratsioon pärast etappi

Mitme etapi järgse kontsentratsiooni korraga leidmiseks kasutage:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ on algkontsentratsioon
• DF on lahjendustegur
• n on etappide arv
• C_n on kontsentratsioon pärast n etappi

Lahjendustegur peab olema suurem kui 1. Tegur 1 tähendaks, et lahjendust ei toimu. Algkontsentratsioon peab olema suurem kui 0.

See kalkulaator käsitleb 1 kuni 20 etappi ja loetleb nende kõrval ka etapi 0 ehk lahjendamata proovi. Kontsentratsiooni ühik on lihttekstis esitatud märgend, näiteks mg/mL või CFU/mL, ning iga rida esitatakse samas ühikus. Kontsentratsioonid esitatakse kuue tüvenumbrini ja väärtused alla 0,000001 lähevad üle teaduslikule kujule, et väikest tulemust ei kuvataks kunagi nullina.

Lahjendustegur ja lahjendussuhe

Lahjendustegurit 10 kirjutatakse sageli suhtena 1:10. Suhe kirjeldab osade proportsioone, mitte tegurit ennast: 1 osa proovi ja 9 osa lahjendit annavad kokku 10 osa. Tegur näitab, mitu korda väiksem on uue lahuse kontsentratsioon, seega vastab suhe 1:10 lahjendustegurile 10, mitte tegurile 11.

Levinud lahjendustegurid on:

• 10 (1:10): mikrobioloogias tavapärane valik, kuna see katab väheste etappidega laia kontsentratsioonivahemiku.
• 2 (1:2): farmakoloogias levinud, kui annuse-toime kõvera joonistamiseks on vaja väiksemaid samme.
• 5 (1:5): vahepealne valik, mis annab rohkem andmepunkte kui 1:10, kuid nõuab vähem etappe kui 1:2.

Näide: bakterikultuuri lahjendamine

Vedelkultuur sisaldab hinnanguliselt 10⁸ kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU) milliliitri kohta, mis on otse loendamiseks liiga tihe. Loendamiseks peab plaadil olema 30 kuni 300 kolooniat, seega vajab proov 1:10 seeriat 6 etapiga.

Etapist 5 võetud 100 μL (0,1 mL) külvamine annab plaadile ligikaudu 10² = 100 CFU-d, mis jääb loendatavasse vahemikku.

Näide: kahekordne ravimilahjenduste seeria

Eeldatakse, et ravimi IC50 (kontsentratsioon, mis vähendab aktiivsuse poole võrra) on ligikaudu 25 mg/mL. Selle väärtuse ümbruse testimiseks on vaja 1:2 seeriat, mille algkontsentratsioon on 100 mg/mL ja milles on 5 etappi.

See seeria hõlmab eeldatavat IC50 väärtust ja annab annuse-toime kõvera joonistamiseks piisavalt punkte.

Kuidas teha jadalahjendust

1. Märgistage iga katseklaas enne alustamist etapinumbri ja lahjendusteguriga.
2. Lisage lahjendit igasse katseklaasi peale selle, milles on algne proov. 1:10 seeria korral lisage 9 ruumala lahjendit 1 ruumala proovi sisaldavasse katseklaasi.
3. Viige mõõdetud ruumala algsest proovist esimesse katseklaasi ja segage põhjalikult kas vorteksiga või pipeteerides mitu korda üles ja alla.
4. Kasutades uut otsikut, viige esimesest katseklaasist sama ruumala teise katseklaasi ja segage uuesti.
5. Korrake ülekandmise ja segamise etappi iga ülejäänud katseklaasi puhul.
6. Kasutage lahjendatud proove kiiresti, sest elusrakud jätkavad kasvamist ja mõned ühendid lagunevad aja jooksul.

Jadalahjenduse kasutusalad

Mikrobioloogias kasutatakse jadalahjendust bakterite plaadiloenduseks ja minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) määramiseks, millega leitakse väikseim antibiootikumiannus, mis peatab bakterite kasvu. Biokeemias kasutatakse seda valkude analüüside standardkõverate koostamiseks ja DNA matriitside ettevalmistamiseks PCR-i jaoks sobivas kontsentratsioonis. Farmakoloogias kasutatakse lahjendusseeriaid ravimite testimiseks eri annuste vahemikus ja selliste väärtuste nagu IC50 arvutamiseks. Immunoloogias kasutatakse seda ELISA kalibreerimiskõverate ja antikehade tiitrimise jaoks, mille käigus määratakse suurim lahjendus, mis annab veel positiivse tulemuse.

Levinud vead

Iga katseklaasi halb segamine on sage veaallikas, sest osakesed ja rakud võivad ühtlase jaotumise asemel põhja settida. Pipetiotsa taaskasutamine võib kanda kontsentreeritumast katseklaasist üle piisavalt materjali, et mõjutada hilisemaid näite. Lahjendussuhte segiajamine lahjendusteguriga põhjustab valed ruumalad: 1:10 lahjendus tähendab 1 osa proovi ja 9 osa lahjendit, mitte 1 osa ja 10 osa. Kontsentratsiooni ümardamine igal etapil selle asemel, et arvutada lõppväärtus otse valemist C₀/DF^n, võib mitme etapi jooksul põhjustada märgatava vea kuhjumise.

Ajalugu

Robert Koch töötas 1880. aastatel tuberkuloosi ja koolera uurimise käigus välja bakterikolooniate kvantitatiivse loendamise meetodid, pannes aluse tänapäevalgi kasutatavale plaadiloendusmeetodile. Heinrich Schnitgeri 1957. aastal leiutatud õhknihkega mikropipett võimaldas hiljem täpselt mõõta mikroliitriseid mahtusid, muutes peened ja korratavad lahjendusseeriad molekulaarbioloogia ja immuunanalüüside jaoks praktiliseks.

Korduma kippuvad küsimused

Kuidas jadalahjendust arvutada? Kasutage valemit C_n = C₀ / DF^n, kus C₀ on algkontsentratsioon, DF on lahjendustegur ja n on etappide arv. Näiteks annab 100 mg/mL lahjendamine teguriga 10 3 etapi jooksul tulemuseks 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Mis vahe on lahjendusteguril ja lahjendussuhtel? Lahjendussuhe, näiteks 1:10, kirjeldab osi: 1 osa proovi segatakse 9 osa lahjendiga, et saada kokku 10 osa. Lahjendustegur on arv 10 ise, mis tähendab, et lahus on kümme korda väiksema kontsentratsiooniga.

Miks kasutada ühe suure lahjenduse asemel mitut väikest lahjendusetappi? Väikseid võrdse ruumalaga ülekandeid on lihtsam täpselt pipeteerida kui üht väga suurt lahjendust. Kuue 1:10 etapiga saavutatakse samuti miljonikordne lahjendus, mida on ühe etapiga raske täpselt teha.

Kui täpne on jadalahjendus? Kalibreeritud pipettide ja hoolika töövõtte korral jääb seeria täpsus tavaliselt vahemikku 5 kuni 10 protsenti, mis sobib enamiku mikrobioloogiliste tööde jaoks. Rangemat täpsust nõudvates rakendustes, näiteks ravimainete standardite puhul, kasutatakse sageli paralleelseid lahjendusi, mis valmistatakse otse lähteainest.

Kui suur on kasulik lahjendusetappide maksimumarv? See kalkulaator võimaldab kuni 20 etappi. Enamik laboriprotokolle kasutab 6 kuni 10 etappi, sest iga täiendava ülekandmisega viga suureneb. Suurem lahjendustegur vähendab vajalike etappide arvu; näiteks kolm 1:100 etappi saavutavad sama 10⁻⁶ lahjenduse kui kuus 1:10 etappi.

Kas lahjendustegur võib sama seeria eri etappides muutuda? Jah, kuid enamik protokolle hoiab teguri muutumatuna, sest kindlat tegurit on lihtsam arvutada, pipeteerida ja korrata. Muutuvat seeriat kasutatakse mõnikord siis, kui üks kontsentratsioonivahemiku osa vajab teisest täpsemat eraldusvõimet.