DNA Hübridiseerimise Temperatuuri Kalkulaator | Tasuta PCR Tm Tööriist

Mis on DNA praimerite seondumistemperatuuri kalkulaator?

DNA praimerite seondumistemperatuuri kalkulaator hindab DNA praimeri sulamistemperatuuri (Tm) selle järjestuse põhjal. Tm on temperatuur, mille juures pooled praimerimolekulid on sihtjärjestuse ahelaga seotud ja pooled ei ole. Polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR) määrab see väärtus temperatuuri, mida kasutatakse praimerite seondumiseks DNA matriitsiga.

Miks on seondumistemperatuur PCR-is oluline?

PCR kopeerib DNA sihtmärkjärjestust korduvate kuumutamis- ja jahutamistsüklite abil. Igal tsüklil on kolm etappi. Esmalt eraldab kuumutamine kaksikahelalise matriitsi temperatuuril umbes 95 °C. Seda etappi nimetatakse denaturatsiooniks. Teiseks jahtub reaktsioon seondumistemperatuurini, tavaliselt vahemikku 50 °C kuni 65 °C, et lühikesed praimerid saaksid üheahelaliste ahelate sobivate järjestustega seonduda. Kolmandaks tõuseb temperatuur umbes 72 °C-ni ning DNA polümeraasiks nimetatav ensüüm pikendab praimereid, moodustades uusi DNA ahelaid.

Kui seondumistemperatuur on liiga madal, seonduvad praimerid järjestustega, mis sobivad ainult osaliselt, tekitades täiendavaid soovimatuid DNA-fragmente. Kui temperatuur on liiga kõrge, ei saa praimerid matriitsiga stabiilset sidet moodustada ning DNA-d kopeeritakse vähe või üldse mitte. Seondumistemperatuur on üks esimesi seadistusi, mida teadlased PCR-reaktsiooni ebaõnnestumisel muudavad.

Kuidas mõjutab GC-sisaldus Tm-i?

Praimer seondub sihtmärgiga vesiniksidemete kaudu. Guaniini-tsütosiini (G-C) paar moodustab kolm vesiniksidet. Adeniini-tümiini (A-T) paar moodustab kaks. Rohkem G- ja C-aluseid sisaldava praimeri lahutamiseks on vaja rohkem kuumust, seega on selle Tm kõrgem kui sama pikkusega, rohkem A- ja T-aluseid sisaldaval praimeril. GC-sisaldus esitatakse tavaliselt protsendina: G- ja C-aluste arv jagatakse järjestuse kogupikkusega ning korrutatakse 100-ga.

DNA praimerite seondumistemperatuuri valem

See kalkulaator rakendab üht kahest valemist, mis valitakse praimeri pikkuse järgi.

14 nukleotiidi pikkuste või pikemate praimerite puhul kasutab see Marmur-Doty GC-sisalduse valemit:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Siin tähistab N_GC praimeris olevate G- ja C-aluste arvu, mida loetakse otse, mitte protsendina. N on aluste koguarv.

14 nukleotiidist lühemate praimerite puhul kasutab see Wallace'i reeglit:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G ja C tähistavad iga aluse arvu praimeris.

Mõlemad valemid eeldavad tavalisi PCR-i tingimusi: praimeri kontsentratsioon umbes 50 nanomooli ja Na+ kontsentratsioon 50 millimooli.

Näidisarvutus

Vaatleme 19 alusest koosnevat praimerit ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Selle pikkus on 19, mis on 14 või rohkem, seega kasutab kalkulaator Marmur-Doty valemit.

• Pikkus (N) = 19
• G-de arv = 5, C-de arv = 5, seega N_GC = 10 ning GC-sisaldus on 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Valem kasutab GC-aluste arvu 10, mitte GC-protsenti 52,6. Protsendi ekslik kasutamine annab Tm-iks ligikaudu 143 °C, mis ei ole PCR-reaktsiooni jaoks realistlik väärtus temperatuurivahemikus 50 °C kuni 95 °C.

Kuidas seda kalkulaatorit kasutada

Sisestage või kleepige praimeri järjestus, kasutades ainult tähti A, T, G ja C. Kalkulaator kuvab järjestuse pikkuse nukleotiidides (nt), GC-sisalduse protsendina ja arvutatud seondumistemperatuuri Celsiuse kraadides. Tulemuse saab kopeerida laborimärkmetesse või protokolli.

PCR-i seondumistemperatuuri valimine

Tm on arvutuslik hinnang, mitte garanteeritud töötemperatuur. Paljud PCR-protokollid alustavad tegelikku seondumisetappi mõne kraadi võrra arvutatud Tm-ist madalamal temperatuuril ning kohandavad seda geeli tulemuse põhjal. Praimeripaari puhul kasutatakse alguspunktina tavaliselt selle praimeri madalamat Tm-i väärtust. Gradient-PCR, mille käigus tehakse korraga mitu reaktsiooni eri temperatuuridel, on levinud viis testimise teel parima temperatuuri leidmiseks.

Muud Tm-i hindamise viisid

Siin kasutatavad Marmur-Doty ja Wallace'i valemid on ainult aluste koostisel põhinevad kiired ligikaudsed meetodid. On olemas ka teisi meetodeid:

• Naaber-aluste termodünaamika arvestab sellega, kuidas iga külgnevate aluste paar mõjutab stabiilsust, ning seda peetakse standardsete praimerite puhul täpsemaks meetodiks.
• Soolasisaldust arvestavad valemid lisavad paranduse reaktsioonipuhvris olevate Na+ või K+ ioonide kontsentratsiooni jaoks, sest suurem soolakontsentratsioon stabiliseerib DNA kaksikahelat ja tõstab Tm-i.

Eri kalkulaatorid võivad sama praimeri kohta anda erineva Tm-i väärtuse, sest nad kasutavad erinevaid valemeid. PCR-i tegemine ja tulemuse kontrollimine jääb lõplikuks testiks.

Korduma kippuvad küsimused

Mis on DNA praimerite seondumistemperatuur?

See on temperatuur, mille juures DNA praimerid PCR-i ajal matriitsahela sobiva järjestusega seonduvad. Laborites määratakse see tavaliselt mõne kraadi võrra madalamaks kui praimeri arvutatud sulamistemperatuur (Tm).

Kuidas arvutatakse praimeri Tm?

14 aluse pikkuste või pikemate praimerite puhul on Tm = 64,9 + 41 × (GC-aluste arv − 16,4) / pikkus. 14 alusest lühemate praimerite puhul on Tm = 2 × (A+T-aluste arv) + 4 × (G+C-aluste arv).

Miks tõstab GC-sisaldus Tm-i?

G-C aluspaarid moodustavad kolm vesiniksidet, A-T paarid aga kaks. Suurema G- ja C-aluste osakaaluga praimeri lahutamiseks sihtmärgist on vaja rohkem energiat ja seega kõrgemat temperatuuri.

Kas PCR-i seondumistemperatuur peaks olema võrdne arvutatud Tm-iga?

Ei. Enamik protokolle alustab mõne kraadi võrra arvutatud Tm-ist madalamal temperatuuril ja kohandab seda sealt edasi, sest Tm tähistab punkti, kus praimerist on seotud ainult pool.

Kas praimeri pikkus muudab Tm-i?

Jah, kuid mitte lihtsal viisil. Pikkus paikneb Marmur-Doty valemis nimetajas, seega ei ole keskmise GC-sisaldusega pikemal praimeril automaatselt kõrgem Tm kui lühemal, suure GC-sisaldusega praimeril.

Miks annavad eri Tm-i kalkulaatorid erinevaid tulemusi?

Nad kasutavad erinevaid valemeid. Wallace'i reegel, Marmur-Doty GC-sisalduse valem, naaber-aluste termodünaamika ja soolasisaldust arvestavad valemid võivad sama praimeri puhul anda erineva Tm-i, mõnikord mitme kraadi võrra.

Viited

1. Marmur J, Doty P. Deoksüribonukleiinhappe aluselise koostise määramine termilise denaturatsioonitemperatuuri põhjal. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Sünteetiliste oligodeoksüribonukleotiidide hübridiseerumine phi chi 174 DNA-ga. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Polümeeri-, hantli- ja oligonukleotiidse DNA naaber-aluste termodünaamika ühtne käsitlus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.