DNA koopiaarvu kalkulaator | Genoomne analüüsitööriist

DNA koopiaarvu kalkulaator

DNA koopiaarvu kalkulaator hindab, mitu sihtjärjestuse koopiat DNA-proovis leidub. See kasutab proovi kontsentratsiooni ja ruumala ning sihtjärjestuse esinemissagedust pikemas DNA-järjestuses. Molekulaarbioloogia laborid kasutavad sellist hinnangut katsete, näiteks qPCR-i (kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni), kavandamiseks enne kallima ja täpsema analüüsi tegemist.

Mida tähendab DNA koopiaarv

DNA koopiaarv näitab, mitu korda konkreetne järjestus genoomis või proovis esineb. Tüüpiline inimese geen esineb kaks korda: ühe koopia pärib inimene kummaltki vanemalt. Seda arvu võivad muuta mitu tegurit.

• Amplifikatsioon: rohkem kui kaks koopiat. Vähirakud amplifitseerivad sageli kasvu soodustavaid geene, näiteks HER2 mõnes rinnakasvajas.
• Deletsioon: vähem kui kaks koopiat, mõnikord null. Deletsioonid võivad põhjustada geneetilisi häireid.
• Duplikatsioon: tekib lisakoopia kohas, kus peaks olema ainult üks või kaks koopiat.
• Koopiaarvu varieeruvus (CNV): koopiaarvu normaalne erinevus indiviidide vahel, mida leidub olulises osas inimese genoomist.

DNA koopiaarvu valem

Kalkulaator teisendab järjestuse esinemiskorrad ja proovi massi koopiaarvuks järgmise valemi abil:

$\text{Koopiaarv} = \frac{\text{Esinemiskorrad} \times \text{Kontsentratsioon} \times \text{Maht} \times N_A}{\text{DNA pikkus} \times 660 \times 10^{9}}$

Kus:

• Esinemiskorrad — mitu korda sihtjärjestus kogu DNA-järjestuses esineb, kusjuures kattuvad vasted loetakse eraldi.
• Kontsentratsioon — DNA kontsentratsioon nanogrammides mikroliitri kohta (ng/μL), mida tavaliselt mõõdetakse spektrofotomeetri või fluoromeetriga.
• Ruumala — proovi ruumala mikroliitrites (μL).
• $N_A$ — Avogadro arv, 6,022 × 10²³ molekuli mooli kohta. See teisendab DNA moolid molekulide arvuks.
• DNA pikkus — kogu DNA-järjestuse pikkus aluspaarides.
• 660 — ühe DNA aluspaari keskmine molekulmass grammides mooli kohta (g/mol). Aluspaar koosneb kahest paardunud nukleotiidist, ühest kummastki DNA-ahelast.
• 10⁹ — teisendab nanogrammid grammideks.

Valem teisendab esmalt proovi massi DNA-molekulide hulgaks, korrutab selle Avogadro arvuga, et saada proovis olevate DNA-molekulide koguarv, ning korrutab seejärel arvuga, mitu korda sihtjärjestus igas molekulis esineb.

Tööriist aktsepteerib ainult tähti A, T, C ja G. Tühikuid ja reavahetusi eiratakse ning väike- ja suurtähti käsitletakse samaväärselt.

DNA koopiaarvu arvutamine: näide

Võtame 12 aluspaari pikkuse DNA-järjestuse ATCGATCGATCG, mille sihtjärjestus on ATCG, kontsentratsioon 10 ng/μL ja ruumala 20 μL.

Etapp 1: loendage esinemiskorrad. ATCG esineb järjestuses ATCGATCGATCG 3 korda, positsioonidel 1, 5 ja 9.

Etapp 2: leidke DNA kogumass. Kontsentratsioon × ruumala = 10 × 20 = 200 ng.

Etapp 3: teisendage moolideks. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Jagades suurusega (12 aluspaari × 660 g/mol) = 7 920 g/mol, saame 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Etapp 4: teisendage molekulide arvuks. Korrutage Avogadro arvuga: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekuli/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-molekuli.

Etapp 5: korrutage esinemiskordadega. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³ ehk ligikaudu 45 621 212 121 212 koopiat.

See arv tundub väga suur, sest 20 μL suurune proov kontsentratsiooniga 10 ng/μL sisaldab siiski triljoneid lühikesi DNA-molekule. Tegelikes proovides kasutatakse tavaliselt palju pikemaid järjestusi, mistõttu on sama massi korral molekulide arv väiksem.

Kus DNA koopiaarvu analüüsi kasutatakse

Vähi diagnostika. Patoloogialaborid kontrollivad rinnakasvaja koes HER2 koopiaarvu. Tavalises rakus on kaks koopiat. Amplifitseerunud kasvajas võib neid olla kuus või rohkem, mis mõjutab sobivust sihtravile, näiteks trastuzumabile.

Geneetiliste haiguste testimine. Selliste seisundite korral nagu DiGeorge'i sündroom esineb kromosoomilõigu deletsioon. Downi sündroomi korral on kromosoomist 21 üks lisakoopia (trisoomia 21). Koopiate loendamine aitab neid diagnoose kinnitada.

Transgeeni ja plasmiidi kvantifitseerimine. Teadlased kontrollivad, mitu sisestatud geeni koopiat jõudis taime-, looma- või bakterirakku. Tavaliselt eelistatakse üht koopiat, sest mitu koopiat võivad panna raku geeni vaigistama.

Patogeenide ja viiruskoormuse jälgimine. Koopiaarvu hinnangud näitavad, kui palju viiruslikku või bakteriaalset DNA-d proovis leidub. Seda kasutatakse nakkuste jälgimisel ja keskkonnatestides.

Muud koopiaarvu mõõtmise meetodid

See kalkulaator annab järjestuse- ja kontsentratsiooniandmete põhjal kiire hinnangu. Täpsemat tulemust vajavad laborid kasutavad tavaliselt üht järgmistest meetoditest:

• Kvantitatiivne PCR (qPCR): amplifitseerib ja mõõdab DNA-d reaalajas; hea standardkõvera korral on täpsus ligikaudu 15–20%.
• Digitaalne PCR (dPCR): jaotab proovi tuhandeteks väikesteks reaktsioonideks, et teha otsene loendus ilma kalibreerimiskõverata.
• Fluorestsents in situ hübridisatsioon (FISH): loendab järjestusi visuaalselt mikroskoobi all otse rakkudes või kromosoomidel; see on paljudes vähi diagnostika laborites standardmeetod.
• Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS): sekveneerib kogu proovi ja koostab kogu genoomi koopiaarvu profiili korraga.

Korduma kippuvad küsimused

Mis on DNA koopiaarv? See näitab, mitu korda antud DNA-järjestus genoomis või proovis esineb. Enamik inimese geene esineb kaks korda, üks kord kummaltki vanemalt pärituna. Lisakoopiad või puuduvad koopiad võivad mõjutada tervist ja haigusriski.

Kui täpne see kalkulaator on? See annab sisestatud andmetel põhineva teoreetilise hinnangu, mitte laborimõõtmise tulemuse. Täpsus sõltub sellest, kui täpselt kontsentratsiooni mõõdeti ja kui spetsiifiline on sihtjärjestus. Avaldatavate tulemuste jaoks on sellised meetodid nagu digitaalne PCR täpsemad.

Kas seda kalkulaatorit saab kasutada RNA puhul? Ei. RNA kasutab tümiini asemel uratsiili ja teistsugust suhkrut, mistõttu erineb selle molekulmass DNA omast. RNA keskmine molekulmass nukleotiidi kohta on ligikaudu 330 g/mol, DNA aluspaari kohta aga ligikaudu 660 g/mol. DNA-valemi kasutamine RNA-andmetel annaks vale tulemuse.

Miks loetakse kattuvat järjestust rohkem kui üks kord? Kalkulaator loendab iga positsiooni, kus sihtjärjestus sobib, isegi kui vastetel on ühiseid tähti. Järjestus ATA sobib järjestuses ATATAT kaks korda, positsioonil 1 ja positsioonil 3, sest iga alguspositsiooni kontrollitakse eraldi.

Milline DNA kontsentratsioonivahemik töötab kõige paremini? Kontsentratsioonid 10–100 ng/μL annavad tavalistel laboriseadmetel kõige usaldusväärsemad näidud. Kontsentratsioonist 10 ng/μL allpool suureneb mõõtmisviga ning tavalise spektrofotomeetri asemel soovitatakse kasutada tundlikumat meetodit, näiteks fluoromeetrit.

Kas see kalkulaator saab hinnata plasmiidi koopiaarvu? Jah. Sisestage DNA-järjestusena kogu plasmiidi järjestus ja sihtjärjestusena insertsiooni unikaalne piirkond ning lisage mõõdetud plasmiidi kontsentratsioon ja proovi ruumala.