DNA kontsentratsiooni kalkulaator

DNA kontsentratsiooni kalkulaator teisendab UV-kiirguse neeldumise näidu lainepikkusel 260 nanomeetrit, mida nimetatakse A260-ks, DNA kontsentratsiooniks nanogrammides mikroliitri kohta (ng/µL). Samuti näitab see proovis oleva DNA koguhulka mikrogrammides (µg).

Mis on A260 neeldumine?

A260 on ultraviolettvalguse hulk, mida lahus neelab lainepikkusel 260 nanomeetrit. DNA neelab UV-valgust kõige tugevamini selle lainepikkuse lähedal oma nukleotiidsete aluste tõttu. Spektrofotomeeter mõõdab A260 pärast nullmõõtmist, mille puhul kasutatakse prooviga sama puhvrit ja eemaldatakse taustneeldumine. Mida rohkem on lahuses DNA-d, seda suurem on A260 näit.

DNA kontsentratsiooni valem

Kaheahelaline DNA neelab UV-valgust võrdeliselt oma kontsentratsiooniga; seda seost nimetatakse Beer-Lamberti seaduseks. Standardse 1-sentimeetrise optilise teepikkuse korral sisaldab lahus, mille A260 näit on 1,0, ligikaudu 50 ng/µL kaheahelalist DNA-d. See arv ehk teisendustegur teisendab mis tahes A260 näidu kontsentratsiooniks:

DNA kontsentratsioon (ng/µL) = A260 × 50 × lahjendustegur

Lahjendustegur võtab arvesse enne proovi mõõtmist tehtud lahjendust. Lahjendamata proovi korral on lahjendustegur 1.

Kuidas arvutada DNA kogusaagist

Kui kontsentratsioon on teada, saab proovis oleva DNA kogumassi leida selle mahu põhjal:

DNA koguhulk (µg) = kontsentratsioon (ng/µL) × maht (µL) ÷ 1000

Kuidas arvutada DNA kontsentratsiooni: samm-sammult

Enne mõõtmist segage proov põhjalikult. DNA võib kleepuda katsuti seintele või settida ebaühtlaselt.
Kui proov on väga kontsentreeritud, lahjendage seda nii, et A260 näit jääks vahemikku 0,1–1,0. Sellest vahemikust väljaspool on spektrofotomeetri näidud kõige ebausaldusväärsemad.
Nullige spektrofotomeeter lahjendamiseks kasutatud sama puhvriga ja mõõtke seejärel proovi lainepikkusel 260 nm.
Sisestage A260 näit, proovi maht ja lahjendustegur kalkulaatorisse, et saada kontsentratsioon ja kogusaagis. Enne tulemuse kuvamist peavad kõik kolm välja olema täidetud ning maht peab olema suurem kui null.

Näidisarvutus

Näide 1: lahjendamata proov

A260 näit on 0,5, lahjendust ei tehtud (lahjendustegur 1) ja proovi maht on 100 µL.

Kontsentratsioon = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
DNA koguhulk = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Näide 2: lahjendatud proov

Katsutis on 50 µL puhastatud DNA-d. Väike osa sellest lahjendati 10 korda ja lahjendatud osa A260 näit oli 0,75. Lahjendustegur teisendab selle näidu tagasi algses katsutis oleva lahuse kontsentratsiooniks ning kogusaagise arvutamisel sisestatakse mahuks 50 µL.

Kontsentratsioon = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
DNA koguhulk = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Lahjendusteguri arvutamine

Lahjendustegur = lahjendamisjärgne kogumaht ÷ algse proovi maht.

Kui 5 µL DNA-lahusele lisada 45 µL puhvrit, on kogumaht 50 µL, seega on lahjendustegur 50 ÷ 5 = 10. Lahjendamata proovi lahjendustegur on 1.

Tüüpilised DNA kontsentratsioonivahemikud

Kontsentratsioon sõltub proovi tüübist ja eraldamismeetodist. Genoomse DNA ekstraktide kontsentratsioon jääb tavaliselt ligikaudu vahemikku 10–100 ng/µL. Plasmiidse DNA preparaatide kontsentratsioon on sageli suurem, ulatudes mõnikord mitmesaja ng/µL-ni. Meetodi puhul eeldatavast vahemikust väga erinev tulemus võib viidata probleemile DNA eraldamisel või mõõtmisel.

UV-neeldumise mõõtmise piirangud

A260 mõõtmine on kiire, kuid DNA puhul ei ole see kõige tundlikum ega spetsiifilisem meetod. Ka valgud, RNA ja mõned puhvri koostisosad neelavad valgust lainepikkuse 260 nm lähedal ning võivad näitu suurendada. Valgukontaminatsiooni tuvastamiseks kontrollivad teadlased sageli koos kontsentratsiooniga ka A260/A280 suhet; suhe ligikaudu 1,8 näitab tavaliselt puhast DNA-proovi. Fluorestsentsetel värvainetel põhinevad meetodid, näiteks Qubiti testid, seonduvad ainult kaheahelalise DNA-ga ja annavad lahjendatud või ebapuhaste proovide korral täpsema näidu, kuid nõuavad lisareaktiive ja fluoromeetrit.

Korduma kippuvad küsimused

Kuidas arvutada DNA kontsentratsiooni A260 põhjal?

Korrutage A260 näit 50-ga, mis on kaheahelalise DNA standardne teisendustegur, ja seejärel lahjendusteguriga. Kui proovi ei lahjendatud, kasutage lahjendustegurit 1.

Milline on hea A260/A280 suhe?

Suhe ligikaudu 1,8 näitab tavaliselt puhast DNA-proovi. Väiksem suhe viitab valgukontaminatsioonile. Suhe üle 2,0 võib viidata RNA-kontaminatsioonile.

Kas seda kalkulaatorit saab kasutada RNA puhul?

Mitte otse, sest RNA puhul kasutatakse teisendustegurit 40 ng/µL, mitte 50. RNA kontsentratsiooni hindamiseks korrutage kalkulaatori tulemus 0,8-ga (40 ÷ 50) või kasutage otse valemit A260 × 40 × lahjendustegur.

Miks peaks A260 näit jääma vahemikku 0,1–1,0?

Neeldumine on Beer-Lamberti seaduse kohaselt peamiselt selles vahemikus kontsentratsiooniga ligikaudu võrdelises seoses. Väljaspool seda vahemikku muutuvad näidud ebausaldusväärsemaks, mistõttu liiga kontsentreeritud või liiga lahjendatud proovi tuleb enne uut mõõtmist lahjendada või kontsentreerida.

Mis vahe on kontsentratsioonil ja puhtusel?

Kontsentratsioon näitab DNA kogust ühikutes ng/µL. Puhtus näitab proovi puhtust ning seda hinnatakse peamiselt neeldumissuhete, näiteks A260/A280, põhjal. Proov võib olla suure kontsentratsiooniga ja siiski ebapuhas või väikese kontsentratsiooniga ja väga puhas.

Kuidas teisendada ng/µL ühikuks µg/mL?

Need kaks ühikut on arvuliselt võrdsed. 1 ng/µL võrdub 1 µg/mL, sest nii massiühik kui ka mahuühik muutuvad teguri 1000 võrra.

Viited

Sambrook, J. ja Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. väljaanne). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R. ja Desjardins, P. R. (2006). DNA ja RNA kvantifitseerimine neeldumis- ja fluorestsentsispektroskoopia abil. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). A260/A280 suhete väärtus nukleiinhapete puhtuse mõõtmisel. BioTechniques, 19(2), 208–210.

DNA kontsentratsiooni kalkulaator | A260 kuni ng/μL teisendaja