Arvuta DNA kontsentratsioon neelamisnäitude (A260) põhjal, kasutades reguleeritavaid lahjendustegureid. Oluline tööriist molekulaarbioloogia laborites ja geneetilises uurimises.
DNA kontsentratsioon arvutatakse järgmise valemi abil:
DNA kontsentratsiooni kalkulaator on hädavajalik veebitööriist, mis aitab molekulaarbioloogidel, geneetikutel ja laboritehnikutel täpselt määrata DNA kontsentratsiooni spektrofotomeetriliste mõõtmiste põhjal. See tasuta kalkulaator kasutab standardset A260 meetodit, et muuta UV-absorptsiooni mõõtmised täpseteks DNA kontsentratsiooni väärtusteks ng/μL.
DNA kontsentratsiooni mõõtmine on põhimenetlus molekulaarbioloogia laborites, olles kriitiline kvaliteedikontrolli samm enne PCR-i, järjestamist, kloonimist ja muid molekulaartehnikaid. Meie kalkulaator elimineerib käsitsi arvutused ja vähendab vigu, kui määratakse nii kontsentratsiooni kui ka DNA koguseid teie proovides.
DNA kontsentratsiooni arvutamine põhineb Beer-Lamberti seadusel, mis ütleb, et lahuse absorptsioon on otseselt proportsionaalne absorbeeriva aine kontsentratsiooniga lahuses ja valguse teepikkusega läbi lahuse. Kahe ahelaga DNA puhul vastab 1,0 absorptsioon 260nm (A260) 1cm teepikkuse kuvetis kontsentratsioonile umbes 50 ng/μL.
DNA kontsentratsioon arvutatakse järgmise valemi abil:
Kus:
Proovis oleva DNA koguse saab seejärel arvutada järgmiselt:
Absorptsioon 260nm juures (A260):
Konversioonitegur (50):
Lahjendustegur:
Maht:
Järgige seda lihtsat protsessi, et arvutada DNA kontsentratsioon oma A260 mõõtmistest:
DNA kontsentratsiooni mõõtmine on hädavajalik paljude molekulaarbioloogia ja teadusuuringute rakenduste jaoks:
Enne DNA fragmentide ligatsiooni vektoritesse võimaldab täpne kontsentratsiooni teadmine teadlastel arvutada optimaalse sisendi ja vektori suhte, maksimeerides transformatsiooni efektiivsust. Näiteks 3:1 moolaratio sisendi ja vektori vahel annab sageli parimaid tulemusi, mis nõuab mõlema komponendi täpseid kontsentratsiooni mõõtmisi.
PCR reaktsioonid vajavad tavaliselt 1-10 ng mall DNA-d optimaalse amplifikatsiooni jaoks. Liialt vähe DNA-d võib põhjustada amplifikatsiooni ebaõnnestumise, samas kui liiga palju võib reaktsiooni pärssida. Kvantitatiivse PCR-i (qPCR) puhul on isegi täpsem DNA kvantifitseerimine vajalik, et tagada täpsed standardkõverad ja usaldusväärne kvantifitseerimine.
NGS raamatukogu ettevalmistamise protokollid määravad täpsed DNA sisendi kogused, sageli vahemikus 1-500 ng sõltuvalt platvormist ja rakendusest. Täpne kontsentratsiooni mõõtmine on hädavajalik eduka raamatukogu ettevalmistamise ja proovide tasakaalustatud esindatuse tagamiseks mitme järjestuse käigus.
Kui DNA-d tutvustatakse eukarüootsetes rakkudes, varieerub optimaalne DNA kogus rakutüübi ja transfektsioonimeetodi järgi. Tüüpiliselt kasutatakse 0.5-5 μg plasmidi DNA-d iga hästi 6-well plaadi formaadis, mis nõuab täpset kontsentratsiooni mõõtmist katsete standardiseerimiseks.
Kriminaalasjades on DNA proovid sageli piiratud ja väärtuslikud. Täpne kvantifitseerimine võimaldab kriminaalbioloogidel määrata, kas piisavalt DNA-d on olemas profiilimiseks ja standardiseerida DNA kogus edasistes analüüsides.
Restriktsioonensüümidel on spetsiifilised aktiivsusüksused, mis on määratletud μg DNA kohta. Täpse DNA kontsentratsiooni teadmine võimaldab õigete ensüümi ja DNA suhete tagamist, tagades täieliku seedimise ilma star-aktiivsuseta (mittespetsiifiline lõikamine).
Kuigi UV spektrofotomeetria on kõige levinum meetod DNA kvantifitseerimiseks, eksisteerib mitmeid alternatiive:
Fluoromeetrilised Meetodid:
Agaroosi Geel Elektrooforees:
Reaalajas PCR:
Digitaalne PCR:
Võime täpselt mõõta DNA kontsentratsiooni on oluliselt arenenud koos molekulaarbioloogia edusammudega:
Pärast DNA struktuuri avastamist Watsoni ja Cricki poolt 1953. aastal hakkasid teadlased arendama meetodeid DNA isoleerimiseks ja kvantifitseerimiseks. Varased lähenemised tuginesid kolorimeetrilistele katsetele, nagu diphenylamine reaktsioon, mis tootis sinise värvi, kui see reageeris DNA deoksüriboosi suhkruga. Need meetodid olid suhteliselt tundmatud ja kalduvad häiretele.
UV spektrofotomeetria rakendamine nukleiinhapete kvantifitseerimisel sai laialdaselt levinud 1970ndatel. Teadlased avastasid, et DNA neelab UV-valgust maksimaalselt 260nm juures ja et absorptsiooni ja kontsentratsiooni suhe on teatud vahemikus lineaarne. Konversioonitegur 50 ng/μL kahe ahelaga DNA jaoks A260 = 1.0 määrati sellel perioodil.
DNA-spetsiifiliste fluoreskentsvärvide arendamine 1980ndatel ja 1990ndatel revolutsiooniliselt muutis DNA kvantifitseerimist, eriti lahjendatud proovide puhul. Hoechst värvid ja hiljem PicoGreen võimaldasid palju tundlikumat tuvastamist kui spektrofotomeetria. Need meetodid muutusid eriti oluliseks PCR-i tekkimisega, mis nõudis sageli täpset kvantifitseerimist väikestes DNA kogustes.
Mikromahu spektrofotomeetrite, nagu NanoDrop, tutvustamine 2000ndate alguses muutis rutiinset DNA kvantifitseerimist, nõudes vaid 0.5-2 μL proovi. See tehnoloogia elimineeris lahjenduste ja kuvetide vajaduse, muutes protsessi kiiremaks ja mugavamaks.
Tänapäeval on edasijõudnud tehnikad, nagu digitaalne PCR ja järgmise põlvkonna järjestamine, viinud DNA kvantifitseerimise piire veelgi kaugemale, võimaldades spetsiifiliste järjestuste absoluutset kvantifitseerimist ja ühe molekuli tuvastamist. Siiski jääb aastakümnete jooksul kehtestatud põhiline spektrofotomeetriline põhimõte rutiinse DNA kontsentratsiooni mõõtmise aluseks laborites üle kogu maailma.
Vaadakem mõningaid praktilisi näiteid DNA kontsentratsiooni arvutamisest:
Teadlane on puhastanud plasmidi ja saanud järgmised mõõtmised:
Arvutus:
Pärast genoomse DNA ekstraheerimist verest:
Arvutus:
Järjestamise protokoll nõuab täpselt 500 ng DNA-d:
Vajalik maht = 500 ÷ 125 = 4 μL DNA lahust
Siin on näited, kuidas arvutada DNA kontsentratsiooni erinevates programmeerimiskeeltes:
1' Exceli valem DNA kontsentratsiooni jaoks
2=A260*50*Lahjendustegur
3
4' Exceli valem DNA koguse arvutamiseks μg-des
5=(A260*50*Lahjendustegur*Maht)/1000
6
7' Näide lahtris, kus A260=0.5, Lahjendustegur=2, Maht=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Tulem: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Arvuta DNA kontsentratsioon ng/μL
4
5 Parameetrid:
6 absorbance (float): Absorptsiooni mõõtmine 260nm juures
7 dilution_factor (float): Proovi lahjendustegur
8
9 Tagastab:
10 float: DNA kontsentratsioon ng/μL
11 """
12 return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15 """
16 Arvuta DNA kogus μg-des
17
18 Parameetrid:
19 concentration (float): DNA kontsentratsioon ng/μL
20 volume_ul (float): DNA lahuse maht μL-des
21
22 Tagastab:
23 float: Kogus DNA μg-des
24 """
25 return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Näide kasutamisest
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"DNA Kontsentratsioon: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Kogus DNA: {total_dna:.2f} μg")
37function calculateDNAConcentration(absorbance,
Avasta rohkem tööriistu, mis võivad olla kasulikud teie töövoos