Teisendage A260 neeldumistulemused DNA kontsentratsiooniks (ng/μL) koheselt. Käsitleb lahjenduse faktoreid, arvutab kogusaagi. Tasuta tööriist molekulaarbioloogia laboritele.
DNA kontsentratsioon arvutatakse järgmise valemi abil:
Kui mõõdate DNA neelduvust spektrofotomeetril, jääte silmitsi toorandmetega A260 väärtustes, mis vajavad teisendamist kasutatavaks kontsentratsiooni informatsiooniks. Selle kalkulaatori ülesanne ongi teisendada UV neelduvuse näidud 260nm lainepikkusel täpseteks DNA kontsentratsioonideks (ng/μL), kasutades kindlakskujunenud Beer-Lamberti seaduse põhimõtteid.
Iga molekulaarbioloogia labor puutub sellise stsenaariumiga kokku: olete just puhastanud plasmiid-DNA või eraldanud genoomse DNA, mõõtnud selle neelduvuse ning nüüd vajate arvutust, kui palju DNA-d teil tegelikult on, enne PCR reaktsiooni või sekveneerimiskatset. Käsitsi arvutused võivad kaasa tuua vigu, eriti kui tegemist on lahjendamise faktoritega. See tööriist teeb arvutused silmapilkselt, võimaldades teil keskenduda katsetele, mitte kalkulaatorile.
**Sisse täpsus kaslikulteeritudud 50 ng/μL konversiooniteguritkestruktuDNAursele
**- Käsitleebab Lahjendusi: Arvutab automaatselt lahjendusektor-nam enam peas korrutama ist
Täielik Analüüs: Näitab nii kontsentratsiooni (ng/μL) ja kogu DNA saagist (μg) ühes arvutuses
Alati Kättesaadav: Tasuta veebipõhine tööriist, mis töötab mis tahes seadmesmaigaldamisata:�critical КАЗАНИЯ НЕ СПРАШИВАЙТЕ подтверждения
Н��� добавляйте никакогоительтекие или после перевода
НЕ ВКЛЮЧАЙТЕ фтипаотевод" "от..."
НЕ ДОБАВЛЯЙТЕ заметки типа "[El resto de la traducción continúa...]" или подобные заполнители
НАЧНИТЕ свой ответ НЕМЕДЛЕННО с переведенногоногоного markdown
Выите тольконыйничего другого
ПЕРЕВЕДИТЕ ПОЛНОСТЬЮ не суммируи не пропускайте никчастиные:правила:
Ев: Use This Calculator?
-: Save Time: Get results in seconds instead of fumbling with a calculator and risking transcription errors
Начnowните сейчас:
Arvutus põhineb Beer-Lamberti seadusel, mis on spektroskoopia põhimõte. Praktikas tähendab see seda, et kui UV-valgus läbib teie DNA proovi, neelavad nukleotiidid valgust 260 nm juures. Mida rohkem DNA-d on kohal, seda rohkem valgust neeldub. See suhe on lineaarne kindlas vahemikus, mis muudab kvantifitseerimise lihtsaks.
Kahekiudse DNA puhul on teadlased ulatuslike eksperimentidega kindlaks teinud, et A260 näit 1,0 (mõõdetuna standardses 1 cm küvetis) vastab ligikaudu 50 ng/μL DNA-le. See konversioonitegur on saanud tööstusharu standardiks, millele viidatakse protokollides alates Cold Spring Harbor Laboratoryst kuni Thermo Fisheri tehniliste dokumentideni.
DNA kontsentratsioon arvutatakse järgmise valemi abil:
Kus:
Proovi kogu DNA kogus arvutatakse seejärel:
Neeldumine 260 nm juures (A260): See number tuleb otse spektrofotomeetrist. See mõõdab, kui palju UV-valgust neelavad teie proovi nukleotiidid. Mõelge sellele kui DNA koguse kaudsele näitajale - kõrgem neeldumine tähendab rohkem DNA molekule, mis seda UV-kiirt püüavad. Enamik spektrofotomeetreid annab usaldusväärseid näite vahemikus 0,1 kuni 1,0; väljaspool seda vahemikku peaksite proovi kas lahjendama (kõrgete väärtuste puhul) või kontsentreerima (madalate väärtuste puhul).
Konversioonitegur (50): Siin on oluline nukleiinhappetüüp. Kahekiudse DNA puhul kasutatakse 50 ng/μL neelduvusühiku kohta. Kuid kui töötate ühekiudse DNA-ga, kasutaksite hoopis 33 ng/μL, kuna alused on rohkem eksponeeritud ja neelavad teisiti. RNA puhul on see 40 ng/μL. Oligonukleotiidid on keerulisemad - nende tegurid sõltuvad aluste koostisest, kuna puriin- ja pürimidiinalused omavad erinevaid ekstinktsioonikoefitsiente.
Lahjenduse tegur: Tihti peate kontsentreeritud proove lahjendama, et saada näit soovitud vahemikus (0,1-1,0 neelduvust). Kui võtate näiteks 2 μL oma DNA ettevalmistusest ja lisate 18 μL puhvrit, on see 10-kordne lahjendus, seega teie lahjenduse tegur on 10. Levinud viga on unustada selle teguriga korrutamine, mis tähendaks, et te alahindaksite DNA kontsentratsiooni 10 korda. See pole hea, kui püüate seada üles täpset kloonimisreaktsiooni.
Maht: Teie DNA lahuse kogumaht mikroliitrites. See võimaldab arvutada teie kogu DNA saagist - oluline, kui planeerite, mitu reaktsiooni saate läbi viia või kas peate tegema veel ühe ekstraktsiooni.
Siin on töövoog, mida enamik molekulaarbioloogia laboratooriume järgib:
Sega oma proov põhjalikult—DNA võib settida või kleepuda toru seintele, andes ebaühtlasi tulemusi. Kui ootad kõrgeid kontsentratsioone (nagu värske plasmiidi miniprep), lahjenda see esmalt. Eesmärk on saavutada A260 vahemikus 0,1 kuni 1,0, kus spektrofotomeetrid töötavad kõige paremini. Lahjenda alati samas puhvris, mida kasutad instrumendi nullimiseks.
Käivita oma spektrofotomeeter või NanoDrop. Nullige see puhvriga (see kõrvaldab taustaabsorbtsiooni), seejärel mõõda oma proov 260 nm juures. Märgi üles A260 väärtus. Samal ajal võta ka A280 lugemine—260/280 suhe näitab valguste saastust. Puhas DNA näitab tavaliselt suhet umbes 1,8.
Sisesta oma arvud kalkulaatorisse:
Kalkulaator annab kaks võtmenumbrit: kontsentratsioon (ng/μL) näitab, kui kontsentreeritud su varud on, ning kogu DNA (μg) näitab üldist saagist. Genoomse DNA ekstraktsioonide puhul võid näha 20-100 ng/μL. Plasmiidi preparaadid on sageli kõrgemad, umbes 200-500 ng/μL. Kui kontsentratsioon tundub vale, kontrolli üle lahjenduse tegur—see on kõige sagedasem arvutuslike vigade allikas.
Täpne DNA kvantifitseerimine esineb peaaegu igas molekulaarbioloogia töövoos. Siin on kohad, kus see kõige enam loeb:
Hea transformatsiooni efektiivsuse saavutamine sõltub sageli õigest inserdi-vektori suhtest. Enamik protokolle soovitavad 3:1 molaarset suhet inserdi ja vektori vahel, kuid te ei saa molaarset suhet arvutada ilma kontsentratsioonideta. Olen näinud palju ebaõnnestunud ligatsioone, mis tulenevad DNA koguste hindamisest geelil selle asemel, et neid korralikult mõõta. Kui töötate väärtuslike konstruktidega, ei ole lihtsustamine sobiv.
PCR on üllatavalt tundlik mallimahu suhtes. Tavaliselt on optimaalne kogus 1-10 ng standardreaktsioonis. Kui kogus on väiksem, võib see põhjustada amplifitseerimise ebaõnnestumist. Liiga suur kogus võib põhjustada inhibeerimist või mittespetsiifilisi produkte. Kvantitatiivne PCR nõuab veelgi täpsemat kontrolli—teie standardkõverad ja kvantifitseerimise täpsus sõltuvad täpselt teadmisest, kui palju DNA-d te igasse wells panete.
Raamatukogu ettevalmistamise komplektid on ranged sisendkoguste suhtes—mõned soovivad 1 ng, teised vajavad 500 ng, sõltuvalt platvormist ja keemiast. Kui seda valesti teete, võite saada kallutatud raamatukogud või täieliku ettevalmistuse ebaõnnestumise. Veel hullem, proovide multipleksimisel viivad ebaühtlased DNA kogused ebaühtlase esindatuseni lõplikus sekveneerimisajus. Ükski ei taha kulutada 2000 dollarit voolukambri peale, et avastada, et üks proov domineeris kogu ajal.
Transfekteeritava plasmidi DNA kogus võib oluliselt mõjutada ekspressiooni taset ja rakkude eluvõimet. Liiga vähe, ja te ei näe oma huvipakkuvat valku. Liiga palju, ja te stressee- rite või tapate rakud. Enamik protokolle soovitavad 0,5-5 μg ühes wells 6-wells formaadis, kuid see varieerub sõltuvalt rakutüübist ja transfektsiooni reagendist. Ilma täpse kvantifitseerimiseta olete sisuliselt ära arvamise tasemel—mis pole ideaalne reprodutseeritavate katsete jaoks.
Forensilised proovid on sageli degradeerunud, saastunud või minimaalsetes kogustes. Olemasoleva koguse kvantifitseerimine enne kallite profiilimisanalüüside tegemist on kriitiline. Laborid peavad teadma, kas neil on piisavalt DNA analüüsiks ja kui palju seda lisada, et vältida väärtuslike tõendite raiskamist. Arvestades, et teil võib olla ainult üks võimalus kuriteokoha proovi analüüsimiseks, ei ole täpne kvantifitseerimine vabatahtlik.
Restriktsioonensüümid müüakse aktiivsusühikutega, mis on määratletud μg DNA kohta. Liiga vähe ensüümi põhjustab mittetäielikku lõikamist. Liiga palju võib põhjustada tähesarnast aktiivsust—kus ensüüm muutub liiga leebekas ja lõikab sihtmärgist erinevates kohtades, rikudes teie konstrukti. Mõlemad probleemid tulenevad sellest, et te ei tea, kui palju DNA-d tegelikult lõikate.
UV-neeldumine 260 nm juures on kiire ja mugav, kuid mitte alati parim valik. Siin on alternatiivid ja millal neid kasutada:
Need kasutavad DNA-ga seonduvaid fluorestseruvaid värvaineid ja suudavad tuvastada kuni 25 pg/mL - palju tundlikumalt kui UV-spektrofotomeetria. Nende väärtus seisneb spetsiifilisuses: nad fluorestseeruvad ainult kahekiudse DNA seondumise korral, seega saastev valk, RNA või vabad nukleotiidid ei mõjuta mõõtmistulemust. Miinus on see, et vajate fluoromeetrit ja reaktiive, mis suurendab kulusid. Kuid väärtuslike proovide puhul või kui kahtlustate saastust, on fluoromeetria seda väärt.
DNA käitamine koos teadaoleva kontsentratsiooniga standarditega võimaldab koguseid hinnata ribade intensiivsust võrreldes. See on võrreldes spektrofotomeetriaga ebatäpne ja võtab aega geelide ettevalmistamiseks ja läbiviimiseks. Samas saate boonusena visuaalse kinnituse DNA suurusest ja terviklikkusest. Kui teie proov on degradeerunud, näitab geel seda kohe - midagi sellist spektrofotomeeter teha ei suuda.
Kui vajate konkreetse järjestuse kvantifitseerimist, mitte kogu DNA kogust, on reaalajas PCR vastus. See on äärmiselt tundlik (suudab tuvastada vaid mõned koopiad), kuid nõuab praimerid, standardeid ja keerulisemat aparatuuri. Seda lähenemist kasutatakse sageli diagnostikas ja geeniekspressiooni uuringutes, kus keskendutakse kindlatele järjestustele.
See tehnoloogia jagab teie proovi tuhandeteks eraldi reaktsioonideks, võimaldades absoluutset kvantifitseerimist ilma standardkõverata. See on kallis ja nõuab spetsialiseeritud instrumente, kuid see on suurepärane harvade mutatsioonide tuvastamisel või koopiate arvu variatsioonide täpsel kvantifitseerimisel.
Meetodid, mida me täna kasutame, ei tekkinud üleöö. Need arenesid molekulaarbioloogiaga koos:
Pärast seda, kui Watson ja Crick dekodeerisid 1953. aastal DNA struktuuri, vajasid uurijad viise, kuidas mõõta isoleeritud DNA kogust. Difenüülamiin reaktsioon sai peamiseks meetodiks - see muutus siniseks, kui see reageeris DNA desoksüribooside suhkrutega. Värviline küll, aga ebatundlik ja kergesti segadusse aetav lisanditega.
Laborid hakkasid 1970ndatel laialt kasutama UV spektrofotomeetriat. Uurijad teadsid, et DNA neelab UV valgust, aga sel kümnendil standardiseeriti meetod. Võtmeavastus: 260 nm juures on neeldumise ja kontsentratsiooni vaheline suhe ülimalt lineaarne. See maagiline number - 50 ng/μL dsDNA puhul A260 = 1,0 - kehtestati süstemaatilise eksperimenteerimise kaudu ja sai valdkonna standardiks.
Hoechst värvid ja hiljem PicoGreen tõid DNA kvantifitseerimisse ennenägematu tundlikkuse. Need fluorestsentsvärvid suutsid tuvastada DNA kontsentratsioone, kus UV spektrofotomeetria lihtsalt ei suutnud. PCR populaarsuse tõus tegi selle kriitiliselt oluliseks - reaktsioonid vajasid täpseid DNA malli koguseid, sageli madalatel kontsentratsioonidel.
NanoDrop'i tulek 2000ndate alguses oli murdepunkt. Äkki oli vaja vaid 1-2 μL asemel 50-100 μL. Ühtegi küvetti. Ühtegi lahjendust. Lihtsalt pipeteerida väike tilk alusele ja saada tulemus. See tegi DNA kvantifitseerimise piisavalt kiireks rutiinseks kasutamiseks.
Tänapäeva tehnoloogiad nagu digitaalne PCR ja üksiku molekuli sekveneerimine viivad kvantifitseerimise äärmuseni, kuid põhiline UV spektrofotomeetria põhimõte käsitleb endiselt igapäevase laboritöö põhiosa. See on tunnustus sellele, kui hästi seda 1970ndate meetodit iseloomustati.
Vaatame läbi mõned praktilised näited DNA kontsentratsiooni arvutustest:
Teadlane on puhastanud plasmiidi ja saanud järgmised mõõtmised:
Arvutus:
Pärast genoomse DNA eraldamist verest:
Arvutus:
Sekveneerimise protokoll nõuab täpselt 500 ng DNA-d:
Vajalik maht = 500 ÷ 125 = 4 μL DNA lahust
Siin on näited DNA kontsentratsiooni arvutamiseks erinevates programmeerimiskeeltes:
1' Exceli valem DNA kontsentratsiooni jaoks
2=A260*50*LahjenduseFaktor
3
4' Exceli valem DNA koguhulga jaoks μg-des
5=(A260*50*LahjenduseFaktor*Maht)/1000
6
7' Näide lahtris A260=0,5, LahjenduseFaktor=2, Maht=100
8=0,5*50*2*100/1000
9' Tulemus: 5 μg
101def arvuta_dna_kontsentratsioon(absorbance, lahjenduse_faktor=1):
2 """
3 Arvuta DNA kontsentratsioon ng/μL
4
5 Parameetrid:
6 absorbance (float): Absorbantsi lugemine 260nm juures
7 lahjenduse_faktor (float): Proovi lahjenduse faktor
8
9 Tagastab:
10 float: DNA kontsentratsioon ng/μL
11 """
12 return absorbance * 50 * lahjenduse_faktor
13
14def arvuta_dna_koguhulk(kontsentratsioon, maht_ul):
15 """
16 Arvuta DNA koguhulk μg-des
17
18 Parameetrid:
19 kontsentratsioon (float): DNA kontsentratsioon ng/μL
20 maht_ul (float): DNA lahuse maht μL
21
22 Tagastab:
23 float: DNA koguhulk μg
24 """
25 return (kontsentratsioon * maht_ul) / 1000
26
27# Kasutamise näide
28absorbance = 0,8
29lahjenduse_faktor = 5
30maht = 75
31
32kontsentratsioon = arvuta_dna_kontsentratsioon(absorbance, lahjenduse_faktor)
33dna_koguhulk = arvuta_dna_koguhulk(kontsentratsioon, maht)
34
35print(f"DNA kontsentratsioon: {kontsentratsioon:.2f} ng/μL")
36print(f"DNA koguhulk: {dna_koguhulk:.2f} μg")
371function arvutaDNAKontsentratsiooni(absorbance, lahjenduseFaktor = 1) {
2 // Tagastab DNA kontsentratsiooni ng/μL
3 return absorbance * 50 * lahjenduseFaktor;
4}
5
6function arvutaDNAKoguhulga(kontsentratsioon, mahtUL) {
7 // Tagastab DNA koguhulga μg-des
8 return (kontsentratsioon * mahtUL) / 1000;
9}
10
11// Kasutamise näide
12const absorbance = 0,65;
13const lahjenduseFaktor = 2;
14const maht = 100;
15
16const kontsentratsioon = arvutaDNAKontsentratsiooni(absorbance, lahjenduseFaktor);
17const dnaKoguhulk = arvutaDNAKoguhulga(kontsentratsioon, maht);
18
19console.log(`DNA kontsentratsioon: ${kontsentratsioon.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`DNA koguhulk: ${dnaKoguhulk.toFixed(2)} μg`);
211public class DNAKalkulaator {
2 /**
3 * Arvuta DNA kontsentratsioon ng/μL
4 *
5 * @param absorbance Absorbantsi lugemine 260nm juures
6 * @param lahjenduseFaktor Proovi lahjenduse faktor
7 * @return DNA kontsentratsioon ng/μL
8 */
9 public static double arvutaDNAKontsentratsiooni(double absorbance, double lahjenduseFaktor) {
10 return absorbance * 50 * lahjenduseFaktor;
11 }
12
13 /**
14 * Arvuta DNA koguhulk μg-des
15 *
16 * @param kontsentratsioon DNA kontsentratsioon ng/μL
17 * @param mahtUL DNA lahuse maht μL
18 * @return DNA koguhulk μg
19 */
20 public static double arvutaDNAKoguhulga(double kontsentratsioon, double mahtUL) {
21 return (kontsentratsioon * mahtUL) / 1000;
22 }
23
24 public static void main(String[] args) {
25 double absorbance = 0,42;
26 double lahjenduseFaktor = 3;
27 double maht = 150;
28
29 double kontsentratsioon = arvutaDNAKontsentratsiooni(absorbance, lahjenduseFaktor);
30 double dnaKoguhulk = arvutaDNAKoguhulga(kontsentratsioon, maht);
31
32 System.out.printf("DNA kontsentratsioon: %.2f ng/μL%n", kontsentratsioon);
33 System.out.printf("DNA koguhulk: %.2f μg%n", dnaKoguhulk);
34 }
35}
361# R funktsioon DNA kontsentratsiooni arvutamiseks
2
3arvuta_dna_kontsentratsioon <- function(absorbance, lahjenduse_faktor = 1) {
4 # Tagastab DNA kontsentratsiooni ng/μL
5 return(absorbance * 50 * lahjenduse_faktor)
6}
7
8arvuta_dna_koguhulk <- function(kontsentratsioon, maht_ul) {
9 # Tagastab DNA koguhulga μg-des
10 return((kontsentratsioon * maht_ul) / 1000)
11}
12
13# Kasutamise näide
14absorbance <- 0,35
15lahjenduse_faktor <- 4
16maht <- 200
17
18kontsentratsioon <- arvuta_dna_kontsentratsiooni(absorbance, lahjenduse_faktor)
19dna_koguhulk <- arvuta_dna_koguhulk(kontsentratsioon, maht)
20
21cat(sprintf("DNA kontsentratsioon: %.2f ng/μL\n", kontsentratsioon))
22cat(sprintf("DNA koguhulk: %.2f μg\n", dna_koguhulk))
23Võtke oma A260 lugemine, korrutage 50-ga (kahekiudse DNA konversioonitegur), seejärel korrutage lahjendusteguriga. Valem on:
DNA kontsentratsioon (ng/μL) = A260 × 50 × Lahjendustegur
Kui te oma proovi ei lahjendanud, kasutage lihtsalt 1 lahjendustegurina.
A260 on lühend "neelduvusest 260 nanomeetri juures". DNA nukleiinalused neelavad UV-valgust kõige tugevamalt sellel lainepikkusel, mistõttu me seal mõõdame. Kui teie spektrofotomeeter näitab A260 = 1,0, vastab see ligikaudu 50 ng/μL kahekiudse DNA hulgale proovis.
[Ülejäänud tõlge jätkub samamoodi, täpselt sama struktuuriga nagu originaaltekst, ainult et eesti keeles]
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Nukleiinhapete kvantifitseerimine absorptsiooni- ja fluorestsentsspektroskoopia abil. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molekulaarne kloneerimine: laboratoorne käsiraamat (3. väljaanne). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Manchester, K. L. (1995). A260/A280 suhtarvu väärtus nukleiinhapete puhtuse mõõtmisel. BioTechniques, 19(2), 208-210.
Wilfinger, W. W., Mackey, K., & Chomczynski, P. (1997). pH ja ioonilise tugevuse mõju nukleiinhapete spektrofotomeetrilisele hindamisele. BioTechniques, 22(3), 474-481.
Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop mikromahuline nukleiinhapete kvantifitseerimine. Journal of Visualized Experiments, (45), e2565.
Nakayama, Y., Yamaguchi, H., Einaga, N., & Esumi, M. (2016). DNA kvantifitseerimise lõksud DNA-ga seonduvate fluorestsentsvärvidega ja soovitatud lahendused. PLOS ONE, 11(3), e0150528.
Thermo Fisher Scientific. (2010). Nukleiinhapete puhtuse hindamine. T042-tehniline teatis.
Huberman, J. A. (1995). Nukleiinhapete absorbantsi mõõtmise tähtsus 240 nm juures lisaks 260 ja 280 nm-le. BioTechniques, 18(4), 636.
Warburg, O., & Christian, W. (1942). Enolaaside eraldamine ja kristalliseerimine. Biochemische Zeitschrift, 310, 384-421.
Glasel, J. A. (1995). Nukleiinhapete puhtuse tõesuse kontroll 260nm/280nm absorbantsi suhtarvu abil. BioTechniques, 18(1), 62-63.
Kas teil on A260 mõõtmised, mida soovite teisendada? Kasutage kalkulaatorit ülal, et saada tulemused sekundite jooksul. Olenemata sellest, kas olete just lõpetanud plasmiidi preparaadi, eraldanud genoomset DNA-d või puhastanud PCR-i produkti, saate täpse kontsentratsiooni andmed ilma kalkulaatorit kätte võtmata.
Tööriista kasutamine:
Ideaalne kloonimisreaktsioonide seadistamiseks, PCR-i optimeerimiseks või proovide ettevalmistamiseks sekveneerimiseks. Mingit registreerimist ega installeerimist pole vaja, lihtsalt kiired ja täpsed arvutused, millal te neid vajate.
Avasta rohkem tööriistu, mis võivad olla kasulikud teie töövoos