DNA ligeerimise kalkulaator - arvutage molekulaarse kloonimise jaoks sisendi:vektori suhteid

Sissejuhatus

DNA ligeerimise molaarse suhtarvu õige määramine võib olla vahe edukate kloonide ja frustreerivate ebaõnnestumiste vahel. Kui olete kunagi kulutanud päevi ligeerimisreaktsiooni tõrkeotsinguks ainult selleks, et avastada, et teie inserdi:vektori suhe oli vale, siis teate, kui kriitilised need arvutused on.

See DNA Ligeerimise Kalkulaator määrab kindlaks optimaalsed vektori ja inserdi DNA kogused molekulaarseks kloonimiseks. Põhimõte on lihtne: saavutada õige molaarne suhe teie plasmiidse vektori ja DNA inserdi vahel. Vähem ilmne on see, et võrdsed massid ei tähenda võrdseid molekule — 1 kb inserdi mass on palju väiksem kui 5 kb vektori mass, seega peate koguseid kohandama fragmentide suuruste järgi.

Tavaliselt toimib praktiliselt järgmine: 3:1 kuni 5:1 molaarne suhe inserdi ja vektori vahel annab usaldusväärseid tulemusi enamikus standardsetes kloonimisrakendustes. Siiski võivad tömpsed ligeerimised sageli kasu saada kõrgematest suhetest, samas kui suured insertid (>10 kb) võivad nõuda madalamaid suhtarve. Need pole suvalised numbrid — need kajastavad molekulaarbioloogide ülemaailmset empiirilise optimeerimise kogemust, mida on dokumenteeritud allikates nagu Cold Spring Harbor'i Molekulaarse Kloonimise käsiraamat ja protokollid New England Biolabs'ist.

Kas te konstrueerite ekspressioonvektoreid, loote geeniraamatukogusid või lahendate keeruka alamkloonimisprojekti tõrkeid, täpsed arvutused säästevad nii aega kui ka kalleid reaktiive. Levinud viga on unustada DNA kontsentratsiooni varieerumisega arvestamine pärast geeli puhastamist — teie nanodrop'i näit on olulisem, kui võib-olla arvate.

DNA ligeerimise valem ja arvutus

DNA ligeerimise arvutus on lihtsam, kui see esialgu tundub. Põhimõtteliselt lahendad molekulaarbioloogilist probleemi: kuidas saavutada õige hulk inserdi molekule vektori molekulide suhtes, kui need on erineva suurusega?

Valem võtab arvesse fragmendi suurusi ja kontsentratsioone, et saavutada soovitud molaarne suhe. Selle arvutuse mõistmine aitab sul tõrkeid lahendada - kui ligeerimine ei toimi, saad kiiresti kontrollida, kas DNA kogused on probleemiks.

Inserdi koguse arvutamine

Vajalik inserdi DNA kogus (nanogrammides) arvutatakse järgmise valemi abil:

$\text{ng inserti} = \text{ng vektorit} \times \frac{\text{kb inserdi suurus}}{\text{kb vektori suurus}} \times \text{molaarne suhe}$

Kus:

• ng vektorit = reaktsioonis kasutatav vektori DNA kogus (tavaliselt 50-100 ng)
• kb inserdi suurus = inserdi DNA fragmendi pikkus kiloalustes (kb)
• kb vektori suurus = vektori DNA pikkus kiloalustes (kb)
• molaarne suhe = soovitud inserdi molekulide ja vektori molekulide suhe (tavaliselt 3:1 kuni 5:1)

Mahuarvutused

Kui vajalik inserdi DNA kogus on kindlaks määratud, arvutatakse reaktsiooniks vajalikud mahud:

$\text{Vektori maht (μL)} = \frac{\text{ng vektorit}}{\text{vektori kontsentratsioon (ng/μL)}}$

$\text{Inserdi maht (μL)} = \frac{\text{ng inserti}}{\text{inserdi kontsentratsioon (ng/μL)}}$

$\text{Puhvri/vee maht (μL)} = \text{Kogu reaktsiooni maht (μL)} - \text{Vektori maht (μL)} - \text{Inserdi maht (μL)}$

Näidisarvutus: 1 kb geeni kloneerimine standardsesse plasmiidi

Vaatame läbi reaalse stsenaariumi - 1 kb geeni kloneerimine tüüpilisse ekspressioonivektorisse:

Teie DNA proovid:

• Vektori kontsentratsioon: 50 ng/μL (värskelt seeditud pET28a)
• Vektori pikkus: 3000 bp (3 kb)
• Inserdi kontsentratsioon: 25 ng/μL (teie PCR-amplifitseeritud geen, geelist puhastatud)
• Inserdi pikkus: 1000 bp (1 kb)
• Sihtmolaarne suhe: 3:1 (insert:vektor)
• Kogu reaktsiooni maht: 20 μL
• Vektori kogus: 50 ng (standardne algkogus)

1. samm: Vajaliku inserdi koguse arvutamine $\text{ng inserti} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Pange tähele, kuidas insert on vektorist kolmandiku võrra väiksem, seega vajame molekulide saavutamiseks vähem massi.

2. samm: Vajalike mahtude arvutamine $\text{Vektori maht} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Inserdi maht} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Puhvri/vee maht} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Mida see praktikas tähendab: Te segate 1 μL vektorit, 2 μL inserti, lisate T4 DNA ligaasi (tavaliselt 1 μL) ja viiakse kogumaht 20 μL-ni ligeerimispuhvriga. See saavutab kolm inserdi molekuli iga vektori molekuli kohta - piisavalt, et reaktsiooni edasi viia, ilma süsteemi üle koormamata.

Kuidas kasutada DNA ligeerimise kalkulaatorit

Selle kalkulaatori kasutamine võtab umbes 30 sekundit, kui olete oma DNA kontsentratsioonid mõõtnud. Siin on töövoog:

1. Sisestage vektori andmed

• Kontsentratsioon ng/μL (kontrollige Nanodrop'i või Qubit'i mõõtmist)
• Pikkus aluspaarina - kontrollige oma plasmiidi kaarti või sekveneerimisandmeid
• Kogus, mida soovite kasutada (50-100 ng sobib hästi enamikuks rakendusteks)

2. Lisage inserdi informatsioon

• Kontsentratsioon ng/μL (mõõtke pärast geeli puhastamist parima täpsuse jaoks)
• Fragmendi pikkus aluspaarina

3. Seadke reaktsiooni parameetrid

• Molaarne suhe: Alustage 3:1 kleepuvate otstega, 5:1 nüride otstega
• Kogumaht: 10-20 μL on standard (väiksemad mahud säästevad reaktiive, suuremad mahud on täpsemalt pipeteeritavad)

4. Vaadake arvutatud mahud üle Kalkulaator näitab teile kohe:

• Täpsed vektori ja inserdi mahud pipeteerimiseks
• Kui palju ligeerimispuhvrit või vett lisada
• DNA kogused teie reaktsioonis

Kui kalkulaator hoiatab, et mahud ei sobi, on teie DNA kas liiga lahjendatud või kogumaht liiga väike. Levinud lahendus: kontsentreerige oma DNA proove või suurendage reaktsiooni mahtu.

Professionaalne nipp: Kopeerige tulemused otse oma laboripäevikusse. Tulevane teie hindab nende arvutuste dokumenteerimist protokolli tõrkeotsingul või optimeerimisel.

Reaalsed rakendused ja kasutusjuhud

Standardne molekulaarne kloneerimine

Enamik teadlasi kasutab seda kalkulaatorit rutiinse kloneerimistöö jaoks—geenide sisestamiseks ekspressioonivektoritesse, alamkloneerimiseks plasmiiride vahel või reporteranalüüside konstrueerimiseks. Arvutused muutuvad aja jooksul teiseks loomuses, kuid nende kontrollimine aitab vältida neid peavalu tekitavaid hetki, kui teie ligatsioon mingil põhjusel ebaõnnestub, kuna kasutasite võrdseid masse asemel võrdsetest molaarmassidest.

Valgu ekspressiooni optimeerimine

Kui te seatate üles valgusüsteeme, on õige ligatsioon esimesel katsel oluline. Kõrge koopiarvuga vektorid nagu pUC derivaadid saavad kasu veidi madalamatest inserdi suhetest (2:1 või 3:1), et vältida ligatsioonireaktsiooni ülekoormamist. See kalkulaator aitab teil neid suhteid täpsustada vastavalt teie konkreetsele vektori suurusele.

CRISPR vektori konstrueerimine

Juhendavate RNA-de kloneerimine CRISPR vektoritesse esitab ainulaadseid väljakutseid—te töötate sageli väga väikeste insertidega (20-100 bp). Kalkulaator käsitleb neid stsenaariumeid, kus intuitsioon alt veab. 60 bp pikkune gRNA insert 9 kb vektorisse nõuab hoolikat suhtarvude arvutamist, ja siin täpne matemaatika päästab teid ebaõnnestunud eksperimentidest.

Sünteetiline bioloogia ja mitme fragmendi kokkupanek

Kuigi Gibson Assembly ja Golden Gate kloneerimine erinevad traditsioonilistest ligatsioonidest, jääb molaarsuhete mõistmine oluliseks. See kalkulaator aitab teil mõelda fragmentide stehiomeetriale, isegi kui kasutate alternatiivseid kokkupaneku meetodeid. Paljud sünteetilise bioloogia uurijad kasutavad seda lähtepunktina enne konkreetse protokolli kohandamist.

Keeruliste ligatsioonide tõrkeotsing

Mõned ligatsioonid on tuntud oma keerukuse poolest:

• Suured insertid (>5 kb): Kasutage madalamaid suhteid (1:1 või 2:1), et vältida steerilisi probleeme
• Väikesed fragmendid (<100 bp): Suurendage suhteid 10:1 või kõrgemaks, et kompenseerida otste parandamise ebaefektiivsust
• Tömbi otstega ligatsioonid: Neil on madalam efektiivsus; alustage 5:1 suhetega ja lisage reaktsioonile PEG
• AT-rikka või GC-rikka järjestusega: Võib vajada suhete optimeerimist—kalkulaator võimaldab süstemaatiliselt eksperimenteerida

Sageli jääb märkamata: pärast geelipuhastust võivad DNA kontsentratsioonid oluliselt erineda teie lähtematerjalist. Alati mõõtke uuesti enne ligatsioonimahu arvutamist.

Millal kaaluda alternatiivseid kloneerimismeetodeid

Traditsiooniline ligatsioon toimib hästi enamikus rakendustes, kuid olemas on ka teised meetodid konkreetsetes stsenaariumides:

Gibson Assembly on muutunud peamiseks meetodiks mitme fragmendi kokkupanemiseks ühes reaktsioonis. Te peate endiselt mõtlema fragmentide suhetele—üldiselt toimivad võrdsed molaarmassid, kuid matemaatika on sarnane. Eriti kasulik keerukate konstruktsioonide loomisel 3+ fragmendiga. Vastavalt originaalsele Gibson Assembly protokollile, annab kõige paremaid tulemusi kõigi fragmentide ligikaudu võrdne molaarmass.

Golden Gate Assembly särab korduvatel kloneerimisprojektidel või kombinatoorsete teekide loomisel. Tüüp IIS restriktsiooniensüümid loovad suunalised, armideta ühendused. Peamine eelis traditsioonilise ligatsiooniga võrreldes on võime ühendada mitu fragmenti kindlas järjekorras ilma armideta. Arvutused on lihtsamad—lihtsalt püüdke saavutada kõigi osade võrdseid kontsentratsioone.

In-Fusion ja sarnased sujuvad kloneerimiskomplektid toimivad hästi, kui soovite vältida restriktsiooniensüüme. Need kasutavad lühikesi (15 bp) homoloogseid piirkondi ja proprieetarseid ensüümide segusid. Need kommertssüsteemid lihtsуstavad arvutusi, kuid lisavad reaktsiooni kohta kulusid—sobivad väikesteks projektideks, kallid rutiinseks tööks.

Gateway kloneerimine on mõistlik, kui te liigutate geene erinevate vektorite vahel, eriti kõrge läbilaskevõimega seadistustes. Esialgne seadistamine nõuab erilisi vektoreid, kuid järgnevad ülekanded on lihtsad. Paljud laborid kasutavad seda ekspressiooni uurimiseks erinevates süsteemides.

Empiirilise optimeerimise meetod jääb kehtima eriti kangekaelsete konstruktsioonide puhul. Seadke üles paralleelsed ligatsioonid suhetega 1:1, 3:1, 5:1 ja 10:1 ning vaadake, milline toimib kõige paremini. See süstemaatiline lähenemine tihti paljastab, et teie konkreetsel vektor-inserdi kombinatsioonil on ebatavalised eelistused. Dokumenteerige see, mis toimib—see teadmine säästab aega tulevaste sarnaste projektide juures.

DNA ligeerimise arvutuste lühiajalugu

DNA ligeerimise arvutuste lugu on seotud rekombinantse DNA tehnoloogia sünniga. Kui Paul Berg, Herbert Boyer ja Stanley Cohen lõid 1970. aastate alguses esimesed rekombinantse DNA molekulid, ei arvutanud keegi molaarsuhteid – teadlased kasutasid proovimise ja eksimise meetodit. T4 DNA ligaas bakteriofaagiga nakatunud E. coli-st sai töövõimeliseks ensüümiks, mis suutis ühendada nii nüride kui ka kleepuvate otstega DNA lõike.

1980. ja 1990. aastatel, kui kloneerimine muutus revolutsioonilisest rutiinseks, hakkasid mustrid kujunema. Laborid märkasid, et liigne inserdi DNA parandas õnnestumise tõenäosust. 3:1 kuni 5:1 molaarsuhe kujunes välja kollektiivse kogemuse põhjal, mida jagati protokollides, Cold Spring Harbori käsiraamatutes ja arvukatel labori koosolekutel. Matemaatiline valem ise on lihtne – ainult molekulmasside erinevuste arvestamine – kuid selle süstemaatiline rakendamine toimus järk-järgult, kuni parimad tavad levisid molekulaarbioloogia kogukonna seas.

Tõeline muutus toimus 2000. aastatel, kui arvutuslikud tööriistad tegid arvutused kättesaadavaks ka väljaspool vaimset arvutamist või kalkulaatoriga töötavaid teadlasi. Veebikalkulaatorid demokratiseerisid täpsuse, olles eriti kasulikud keerulistes stsenaariumites nagu suurte insertide või väikeste fragmentide kloneerimisel, kus intuitsioon alt veab. Huvitaval kombel, isegi kui uued meetodid nagu Gibson Assembly tekkisid, jäi molekulaarsete suhete kontrollimise põhimõte põhiliseks – me lihtsalt rakendame seda erinevalt, sõltuvalt kasutatavast keemiast.

Tänapäeva ligeerimise arvutused põhinevad samal lihtsal matemaatikal, mis töötati välja juba aastakümneid tagasi, täiustatud miljonite edukate (ja ebaõnnestunud) kloneerimiseksperimentidega üle kogu maailma.

Koodinäited

Siin on DNA ligeerimise kalkulaatori rakendused erinevates programmeerimiskeeltes:

1' Excel VBA funktsioon DNA ligeerimise kalkulaatorile
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Arvuta vajalik inserdi kogus nanogrammides
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Arvuta vektori maht mikroliitrites
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Arvuta inserdi maht mikroliitrites
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Arvuta puhvri/vee maht mikroliitrites
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Kasutamise näide lahtris:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Arvuta DNA ligeerimise reaktsiooni mahud.
5    
6    Parameetrid:
7    vector_concentration (float): Vektori DNA kontsentratsioon ng/μL
8    vector_length (float): Vektori DNA pikkus aluspaarina
9    insert_concentration (float): Inserdi DNA kontsentratsioon ng/μL
10    insert_length (float): Inserdi DNA pikkus aluspaarina
11    molar_ratio (float): Soovitud molaarne suhe insert:vektor
12    total_volume (float): Kogu reaktsiooni maht μL
13    vector_amount (float): Kasutatav vektori DNA kogus ng (vaikimisi: 50)
14    
15    Tagastab:
16    dict: Sõnastik arvutatud mahtudest ja kogustest
17    """
18    # Arvuta vektori maht
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Arvuta vajalik inserdi kogus
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Arvuta inserdi maht
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Arvuta puhvri/vee maht
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Kasutamise näide
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Puhver: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Kokku: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Teisenda pikkused kb-ks arvutamiseks
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Arvuta vajalik inserdi kogus
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Arvuta mahud
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Kasutamise näide
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Puhver: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Kokku: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Teisenda pikkused kb-ks
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Arvuta vajalik inserdi kogus
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Arvuta mahud
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Ümarda kahe komakohani
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Puhver: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Kokku: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Teisenda pikkused kb-ks
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Arvuta vajalik inserdi kogus
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Arvuta mahud
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Ümarda kahe komakohani
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Puhver: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Kokku: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Korduma Kippuvad Küsimused

Milline on optimaalne molaarne suhe DNA ligeerimiseks?

Alustage 3:1 (insert:vektor) kleepuvate otstega ligeerimiseks - see suhe toimib usaldusväärselt enamikus standardsetes kloonimisprojektides. Nüride otstega ligeerimistel on madalam efektiivsus, seega tõstke see 5:1 või veelgi kõrgemale.

Siin on see, mis praktikas toimib:

• Kleepuvate otstega ligeerimised: 1:1 kuni 3:1 (alustage 3:1)
• Nüride otstega ligeerimised: 5:1 kuni 10:1
• Suured insertid (>10 kb): 1:1 kuni 2:1 (steerilised takistused muutuvad oluliseks)
• Väikesed insertid (<500 bp): 5:1 kuni 10:1 (kompenseerib võimalikku otste kahjustust)
• Mitme fragmendi kokkupanek: 3:1 iga inserdi kohta vektorist lähtuvalt

Kui pole kindel, tehke paralleelsed reaktsioonid erinevate suhetega. See võtab tunni lisaseadistust, kuid säästab päevi tõrkeotsinguid.

[Ülejäänud tekst jätkub samamoodi, täielikult tõlgituna eesti keelde]

Viited

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molekulaarne kloneerimine: Laboratoorne käsiraamat (3. väljaanne). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molekulaarne kloneerimine: Laboratoorne käsiraamat (4. väljaanne). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). Ühe-potilise, ühe-sammulise, täpse kloneerimise meetod kõrge läbilaskevõimega. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). DNA molekulide ensümaatiline kokkupanek kuni mitmesaja kiloaluseni. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). PCR produktide liigatsioonist sõltumatu kloneerimine (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Makromolekulaarne ummistus võimaldab täisnukaliste ühendamist DNA ligaasidega rotimaksast või Escherichia coli-st. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molekulaarbioloogia viide. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA ligatsioonprotokoll. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molekulaarse kloneerimise tehniline viide. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Kloneerimise tehniline käsiraamat. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/