DNA ligeerimise kalkulaator - arvutage molekulaarse kloonimise jaoks sisendi:vektori suhteid

DNA ligeerimine on molekulaarkloonimise etapp, kus insertfragment ühendatakse plasmiidvektoriga ensüümi T4 DNA ligaasi abil. DNA ligeerimise kalkulaator arvutab, mitu mikroliitrit insert-DNA-d ja vektor-DNA-d tuleb segada, et reaktsioon saavutaks valitud inserti ja vektori molaarse suhte.

Mida kalkulaator teeb

Kalkulaator kasutab kuut sisendit: vektori kontsentratsioon, vektori pikkus, inserti kontsentratsioon, inserti pikkus, inserti ja vektori sihtmolaarne suhe ning reaktsiooni kogumaht. Samuti saab määrata kasutatava vektor-DNA koguse, mille vaikeväärtus on 50 nanogrammi (ng). Nende väärtuste põhjal arvutab kalkulaator pipeteeritava vektori mahu, pipeteeritava inserti mahu ning puhvri või vee koguse, mis tuleb reaktsiooni kogumahu saavutamiseks lisada.

Kontsentratsiooni mõõdetakse nanogrammides mikroliitri kohta (ng/μL) ja tavaliselt loetakse see Nanodropi või Qubiti seadmega. Pikkust mõõdetakse aluspaarides (bp). Üks kilobase (kb) võrdub 1000 aluspaariga. Molaarne suhe näitab, mitu insertmolekuli peaks iga ühe vektormolekuli kohta olema. See ei ole massisuhe.

Miks kasutatakse massi asemel molaarset suhet

Võrdsed DNA massid ei sisalda võrdset arvu molekule. Lühike insert kaalub sama molekulide arvu korral vähem kui pikk vektor. Lühikese inserti ja pika vektori võrdsete nanogrammikoguste segamisel jääks insertmolekule vektormolekulidega võrreldes liiga vähe. Kalkulaator skaleerib inserti massi fragmentide pikkuste suhte järgi, nii et lõppsegus on iga vektormolekuli kohta soovitud arv insertmolekule.

DNA ligeerimise valem

Vajalik insert-DNA kogus nanogrammides on järgmine:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

kus $m_i$ on inserti kogus nanogrammides, $m_v$ vektori kogus nanogrammides, $k_i$ inserti pikkus kilobasides, $k_v$ vektori pikkus kilobasides ja R inserti ning vektori sihtmolaarne suhe.

Kui see kogus on teada, teisendab kalkulaator kummagi koguse pipeteeritavaks mahuks:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

kus $V_v$ ja $V_i$ on vastavalt vektori ja inserti mahud mikroliitrites, $c_v$ ja $c_i$ on vastavalt vektori ja inserti kontsentratsioonid nanogrammides mikroliitri kohta, $V_b$ on puhvri maht ja $V_t$ reaktsiooni kogumaht.

Kui vektori ja inserti mahud kokku on reaktsiooni kogumahust suuremad, ei jää puhvri, ligaasi ega vee jaoks ruumi. Sel juhul teatab kalkulaator, et kogumaht on liiga väike, selle asemel et näidata puhvri negatiivset kogust.

Näidisarvutus

Teadlane kloonib 1 kb pikkuse geenifragmendi 3 kb pikkusesse plasmiidvektorisse. Kavas on kasutada 50 ng vektor-DNA-d inserti ja vektori molaarse suhtega 3:1 ning reaktsiooni mahuga 20 μL.

Sisendid:

• Vektori kontsentratsioon: 50 ng/μL
• Vektori pikkus: 3000 bp (3 kb)
• Inserti kontsentratsioon: 25 ng/μL
• Inserti pikkus: 1000 bp (1 kb)
• Molaarne suhe: 3
• Kogumaht: 20 μL
• Vektori kogus: 50 ng

Etapp 1: inserti kogus

Inserti ng = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Etapp 2: mahud

Vektori maht = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Inserti maht = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Puhvri maht = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaktsioon koosneb 1 μL vektorist, 2 μL insertist ning 17 μL puhvrist või veest, kuhu lisatakse ka ligaas ja selle reaktsioonipuhver. Selle seguga saadakse iga vektormolekuli kohta kolm insertmolekuli.

Ligeerimise tüüpilised molaarsuhted

Enamikus kleepuvate, üleulatuvate otstega standardsetes kloonimistes kasutatakse inserti ja vektori suhet 3:1. Tömpide otste ühendamisel on ligeerimine vähem tõhus, mistõttu on tavaline suurem suhe, näiteks 5:1. Väga suured insertid toimivad mõnikord paremini väiksema suhtega, mis on lähemal väärtusele 1:1, sest suured fragmendid sisaldavad ühe molekuli kohta juba palju aluspaaride.

Korduma kippuvad küsimused

Mis on DNA ligeerimine?

DNA ligeerimine on kahe DNA-fragmendi, tavaliselt plasmiidvektori ja inserti, ühendamine üheks pidevaks molekuliks. Ensüüm T4 DNA ligaas tihendab fragmentide otste vahelise ühenduse.

Mida tähendab inserti ja vektori molaarne suhe?

See on reaktsioonis olevate insert-DNA molekulide arv iga ühe vektormolekuli kohta. Suhe 3:1 tähendab kolme insertmolekuli iga vektormolekuli kohta, olenemata nende masside suhtest.

Miks mitte kasutada vektorit ja inserti võrdsetes nanogrammikogustes?

Erineva pikkusega DNA-fragmentidel on molekuli kohta erinev mass. 1 kb pikkune insert kaalub molekuli kohta umbes kolmandiku 3 kb pikkuse vektori massist. Kummagi võrdsed nanogrammikogused ei annaks võrdset arvu molekule, mistõttu kohandab kalkulaator inserti massi, et saavutada soovitud molaarne suhe.

Mida tähendab, kui kogumaht on liiga väike?

See tähendab, et juba üksnes vektori ja inserti mahud täidavad kogu reaktsioonimahu, nii et puhvri või ligaasi jaoks ei jää ruumi. Lahendus on suurendada reaktsiooni kogumahtu või kasutada kontsentreeritumaid DNA lähtevarusid.

Kas seda kalkulaatorit saab kasutada Gibsoni koostamiseks või Golden Gate'i kloonimiseks?

Ei. Nendes meetodites kasutatakse teistsugust reaktsioonikeemiat ja tavaliselt sihitakse kõigi fragmentide ekvimolaarseid koguseid, mitte kindlat inserti ja vektori suhet. Nende mahtude arvutamine erineb standardsest T4 ligaasiga kloonimisest.

Kui palju vektor-DNA-d tavaliselt kasutatakse?

50 ng on standardse ligeerimisreaktsiooni tavaline algkogus. Laborites kasutatakse ka koguseid 25 kuni 100 ng, kohandades neid DNA kontsentratsiooni ja reaktsiooni ulatuse järgi.