DNA Ligation Calculator

Sissejuhatus

DNA ligatsioon on kriitiline molekulaarbioloogia tehnika, mida kasutatakse DNA fragmentide omavaheliseks ühendamiseks kovalentsete sidemetega. DNA Ligation Calculator on oluline tööriist teadlastele, aidates määrata optimaalsed kogused vektori ja sisendi DNA-d, mis on vajalikud eduka ligatsioonireaktsiooni jaoks. Arvutades õigeid molaarseid suhteid vektori (plasmid) ja sisendi DNA fragmentide vahel, tagab see kalkulaator tõhusad molekulaarkloonimise eksperimendid, minimeerides samas reaktiivide raiskamist ja ebaõnnestunud reaktsioone.

Ligatsioonireaktsioonid on aluseks geneetilisele inseneeriale, sünteetilisele bioloogiale ja molekulaarkloonimise protseduuridele. Need võimaldavad teadlastel luua rekombinantseid DNA molekule, sisestades huvi pakkuvad geenid plasmidvektoritesse, et hiljem need organismidesse viia. Nende reaktsioonide edu sõltub suuresti DNA komponentide sobivate koguste kasutamisest, mida see kalkulaator aitab täpselt määrata.

Olenemata sellest, kas konstrueerite ekspressioonivektoreid, loote geeniraamatukogusid või teete rutiinset subkloneerimist, aitab see DNA ligatsioonikalkulaator optimeerida teie eksperimentaalseid tingimusi ja suurendada teie eduvõimalusi. Sisestades mõned võtmeparameetrid oma DNA proovide kohta, saate kiiresti teada, millised on teie konkreetse ligatsioonireaktsiooni jaoks vajalikud täpsed mahud.

Valem/Arvutus

DNA ligatsioonikalkulaator kasutab põhilist molekulaarbioloogia valemit, mis arvestab erinevate DNA fragmentide suuruste ja kontsentratsioonidega, mida ühendatakse. Peamine arvutus määrab, kui palju sisendi DNA-d on vaja võrreldes vektori DNA-ga, lähtudes nende vastavatest pikkustest ja soovitud molaarsetest suhetest.

Sisendi Koguse Arvutamine

Vajalik sisendi DNA kogus (nanogrammides) arvutatakse järgmise valemi abil:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

Kus:

• ng of vector = reaktsioonis kasutatud vektori DNA kogus (tavaliselt 50-100 ng)
• kb size of insert = sisendi DNA fragmendi pikkus kilobaitides (kb)
• kb size of vector = vektori DNA pikkus kilobaitides (kb)
• molar ratio = soovitud suhe sisendi molekulide ja vektori molekulide vahel (tavaliselt 3:1 kuni 5:1)

Mahu Arvutused

Kui vajalik sisendi DNA kogus on määratud, arvutatakse reaktsiooniks vajalikud mahud:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Näidis Arvutus

Töötame läbi praktilise näite:

• Vektori kontsentratsioon: 50 ng/μL
• Vektori pikkus: 3000 bp (3 kb)
• Sisendi kontsentratsioon: 25 ng/μL
• Sisendi pikkus: 1000 bp (1 kb)
• Soovitud molaarne suhe (sisend:vektor): 3:1
• Kokku reaktsiooni maht: 20 μL
• Vektori kogus, mida kasutada: 50 ng

Samm 1: Arvutage vajalik sisendi kogus $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Samm 2: Arvutage mahud $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

See arvutus tagab, et reaktsioonis on kolm sisendi molekuli iga vektori molekuli kohta, optimeerides seeläbi eduka ligatsiooni võimalusi.

Samm-sammuline Juhend Kalkulaatori Kasutamiseks

Meie DNA ligatsioonikalkulaator on loodud olema intuitiivne ja lihtne. Järgige neid samme, et arvutada optimaalsed mahud oma ligatsioonireaktsiooniks:

1. Sisestage Vektori Teave:

   • Sisestage oma vektori kontsentratsioon ng/μL
   • Sisestage vektori pikkus baaspaarides (bp)
   • Määrake, kui palju vektori DNA-d soovite reaktsioonis kasutada (ng)

2. Sisestage Sisendi Teave:

   • Sisestage oma sisendi kontsentratsioon ng/μL
   • Sisestage sisendi pikkus baaspaarides (bp)

3. Seadke Reaktsiooni Parameetrid:

   • Määrake soovitud molaarne suhe (sisend:vektor) - tavaliselt vahemikus 3:1 kuni 5:1
   • Sisestage kogu reaktsiooni maht μL-des (tavaliselt 10-20 μL)

4. Vaadake Tulemusi:

   • Kalkulaator kuvab automaatselt:
     • Nõutav vektori maht (μL)
     • Nõutav sisendi maht (μL)
     • Lisatava puhvri/vee maht (μL)
     • Kogu reaktsiooni maht (μL)
     • Vektori ja sisendi DNA kogus reaktsioonis (ng)

5. Kopeeri Tulemused (valikuline):

   • Kasutage nuppu "Kopeeri tulemused", et kopeerida kõik arvutused oma lõppmärkmikusse või protokollidesse

Kalkulaator teeb valideerimiskontrolle, et tagada, et kõik sisendid on positiivsed numbrid ja et kogumaht on piisav nõutud DNA mahtude jaoks. Kui tuvastatakse vigu, suunavad abistavad veateated teid sisendite parandamisele.

Kasutusalad

DNA ligatsioonikalkulaator on väärtuslik paljude molekulaarbioloogia rakenduste jaoks:

Molekulaarne Kloonimine

Kõige tavalisem kasutusala on standardne molekulaarne kloonimine, kus teadlased sisestavad geene või DNA fragmente plasmidvektoritesse. Kalkulaator tagab optimaalsed tingimused:

• Geenide subkloneerimine erinevate ekspressioonivektorite vahel
• Fuseerimisvalkude loomine, liites mitu geenifragmenti
• Reklaamigeenide katsetuste koostamine
• Plasmidiraamatukogude loomine

Sünteetiline Bioloogia

Sünteetilises bioloogias, kus sageli koostatakse mitu DNA fragmenti:

• Gibsoni assamblee reaktsioonid saavad kasu täpsetest sisendi:vektori suhetest
• Golden Gate assambleerimissüsteemid nõuavad konkreetseid DNA kontsentratsioone
• BioBrick assamblee standardiseeritud geneetiliste osade jaoks
• Sünteetiliste geneetiliste ringide koostamine

Diagnostikakomplektide Arendamine

Molekulaarsete diagnostikavahendite väljatöötamisel:

• Haiguse spetsiifiliste geneetiliste markerite kloonimine
• Positiivsete kontrollplasmidide koostamine
• qPCR-i kalibreerimisstandardite arendamine

Valkude Ekspressioonisüsteemid

Teadlastele, kes töötavad valkude tootmise kallal:

• Optimeerimine sisendi:vektori suhetes kõrge koopia ekspressioonivektorite jaoks
• Indutseeritavate ekspressioonisüsteemide koostamine
• Sekretsioonivektorite loomine valkude puhastamiseks

CRISPR-Cas9 Rakendused

Genoomi redigeerimise rakendustes:

• Juhendite RNA kloonimine CRISPR vektoritesse
• Donorite mallide loomine homoloogiliselt suunatud parandamiseks
• Juhendite raamatukogude koostamine skriinimiseks

Raskesti Ligatsioonid

Kalkulaator on eriti väärtuslik väljakutsuvate ligatsioonide stsenaariumide jaoks:

• Suurte sisendite kloonimine (>5 kb)
• Väga väikeste fragmentide sisestamine (<100 bp)
• Üksikute otste ligatsioonid, millel on madalam efektiivsus
• Mitme fraktsiooni assambleereaktsioonid

Alternatiivid

Kuigi meie DNA ligatsioonikalkulaator pakub täpseid arvutusi traditsiooniliste ligatsioonireaktsioonide jaoks, eksisteerivad mitmed alternatiivsed lähenemisviisid DNA fragmentide ühendamiseks:

1. Gibsoni Assamblee: Kasutab eksonukleaas, polümeraasi ja ligaasit ühes torus reaktsioonis, et ühendada üksteisega kattuvad DNA fragmentid. Traditsioonilisi ligatsioonikalkulatsioone ei ole vaja, kuid kontsentratsioonisuhted on endiselt olulised.

2. Golden Gate Assamblee: Kasutab tüüpi IIS restriktsioonensüüme suunatud, armideta mitme fraktsiooni assambleerimiseks. Nõuab kõigi fragmentide ekvimolaarsed kogused.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Kasutab eksonukleaas, et luua ühekordsed ülehangud, mis omavahel liituvad. Kasutab tavaliselt fragmentide ekvimolaarsed suhted.

4. In-Fusion Kloonimine: Kaubanduslik süsteem, mis võimaldab fragmentide ühendamist 15 bp kattuvustega. Kasutab konkreetset suhet, mis põhineb fragmentide suurustel.

5. Gateway Kloonimine: Kasutab saidispetsiifilist rekombinatsiooni asemel ligatsiooni. Nõuab konkreetseid sisenemis- ja sihtvektoreid.

6. Empriline Testimine: Mõned laborid eelistavad seadistada mitu ligatsioonireaktsiooni erinevate sisendi:vektori suhetega (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) ja määrata, milline töötab nende konkreetsete konstruktsioonide jaoks kõige paremini.

7. Tarkvarakalkulaatorid: Kaubanduslikud tarkvarapakettid, nagu Vector NTI ja SnapGene, sisaldavad ligatsioonikalkulaatoreid koos lisafunktsioonidega, nagu restriktsioonikohtade analüüs.

Ajalugu

DNA ligatsioonikalkulatsioonide areng on paralleelne molekulaarsete kloonimistehnikate arenguga, mis on revolutsiooniliselt muutnud molekulaarbioloogiat ja biotehnoloogiat.

Varased Arengud (1970ndad)

DNA ligatsiooni kontseptsioon molekulaarses kloonimises tekkis 1970ndate alguses Paul Bergeri, Herbert Boyeri ja Stanley Coheni pioneeritegevuse kaudu, kes arendasid esimesi rekombinantseid DNA molekule. Selles etapis olid ligatsioonireaktsioonid peamiselt empiirilised, teadlased kasutasid katse-eksituse meetodit, et määrata optimaalsed tingimused.

Restriktsioonensüümide ja DNA ligaaside avastamine andis olulised tööriistad DNA molekulide lõikamiseks ja uuesti liitmiseks. T4 DNA ligaas, mis eraldati T4 bakteriofaagiga nakatunud E. coli-st, sai standardseks ensüümiks DNA fragmentide ühendamiseks, kuna see suudab liita nii tuhmad kui ka kohevused.

Täiendamise Periood (1980ndad-1990ndad)

Kuna molekulaarne kloonimine muutus järjest tavalisemaks, hakkasid teadlased arendama süsteemsemaid lähenemisviise ligatsioonireaktsioonidele. Vektori ja sisendi DNA vaheliste molaarsete suhete tähtsus sai selgeks, mis viis põhivalemi väljatöötamiseni, mida kasutatakse siiani.

Selle perioodi jooksul kindlaks tehtud, et liigsete sisendi DNA kasutamine (tavaliselt 3:1 kuni 5:1 molaarne suhe sisendi ja vektori vahel) parandas tavaliselt ligatsiooni efektiivsust standardsetes kloonimistaotlustes. See teadmine jagati algselt laboriprotokollide kaudu ja jõudis järk-järgult molekulaarbioloogia käsiraamatutesse ja õpikutesse.

Kaasaegne Aeg (2000ndad-Käesolev)

Arvutustööriistade ja veebikalkulaatorite ilmumine 2000ndatel tegi täpsete ligatsioonikalkulatsioonide teadlastele kergemini kättesaadavaks. Kuna molekulaarbioloogia tehnikad muutusid keerukamaks, suurenes täpsete arvutuste vajadus, eriti keerukate kloonimisprojektide puhul, mis hõlmavad mitmeid fragmente või suuri sisendeid.

Tänapäeval on DNA ligatsioonikalkulatsioonid lahutamatu osa molekulaarsete kloonimise töövoogudest, pühendatud kalkulaatorid nagu see aitavad teadlastel oma eksperimente optimeerida. Põhivalem on jäänud enamasti muutumatuks, kuigi meie arusaamine ligatsiooni efektiivsust mõjutavatest teguritest on paranenud.

Alternatiivsete kloonimismeetodite, nagu Gibsoni assamblee ja Golden Gate kloonimine, ilmumine on tutvustanud uusi arvutamisvajadusi, kuid DNA fragmentide vaheliste molaarsete suhete põhimõte jääb nende tehnikate puhul endiselt oluliseks.

Koodinäited

Siin on DNA ligatsioonikalkulaatori rakendused erinevates programmeerimiskeeltes:

1' Excel VBA funktsioon DNA ligatsioonikalkulaatori jaoks
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Arvuta nõutav sisendi kogus ng-des
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Arvuta vektori maht μL-des
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Arvuta sisendi maht μL-des
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Arvuta puhvri/vee maht μL-des
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Kasutamise näide rakenduses:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Arvuta mahud DNA ligatsioonireaktsiooni jaoks.
5    
6    Parameetrid:
7    vector_concentration (float): Vektori DNA kontsentratsioon ng/μL
8    vector_length (float): Vektori DNA pikkus baaspaarides
9    insert_concentration (float): Sisendi DNA kontsentratsioon ng/μL
10    insert_length (float): Sisendi DNA pikkus baaspaarides
11    molar_ratio (float): Soovitud molaarne suhe sisend:vektor
12    total_volume (float): Kogu reaktsiooni maht μL-des
13    vector_amount (float): Vektori DNA kogus, mida kasutada ng-des (vaikimisi: 50)
14    
15    Tagastab:
16    dict: Sõnastik, mis sisaldab arvutatud mahtusid ja koguseid
17    """
18    # Arvuta vektori maht
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Arvuta nõutav sisendi kogus
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Arvuta sisendi maht
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Arvuta puhvri/vee maht
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Näidis kasutamine
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Sisend: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Puhver: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Kokku: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Muuda pikkused kb-deks arvutamiseks
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Arvuta nõutav sisendi kogus
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Arvuta mahud
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Näidis kasutamine
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Sisend: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Puhver: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Kokku: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Muuda pikkused kb-deks
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Arvuta nõutav sisendi kogus
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Arvuta mahud
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Ümarda 2 kümnendkohta
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Sisend: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Puhver: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Kokku: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Muuda pikkused kb-deks
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Arvuta nõutav sisendi kogus
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Arvuta mahud
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Ümarda 2 kümnendkohta
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Sisend: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Puhver: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Kokku: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Korduma Kippuvad Küsimused (KKK)

Mis on optimaalne molaarne suhe DNA ligatsiooniks?

Optimaalne molaarne suhe sisendi ja vektori vahel on tavaliselt vahemikus 3:1 kuni 5:1 standardsete kloonimistaotluste jaoks. Siiski võib see varieeruda sõltuvalt konkreetsest ligatsioonist:

• Tuhmsete otste ligatsioonid: 3:1 kuni 5:1
• Kleepuvate otste ligatsioonid: 1:1 kuni 3:1
• Suured sisendid (>10 kb): 1:1 kuni 2:1
• Väikesed sisendid (<500 bp): 5:1 kuni 10:1
• Mitme fraktsiooni assamblee: 3:1 iga sisendi ja vektori puhul

Miks ebaõnnestub mu ligatsioonireaktsioon, kuigi kasutasin arvutatud mahte?

Mitmed tegurid võivad mõjutada ligatsiooni efektiivsust, mis ületavad molaarset suhet:

1. DNA kvaliteet: Veenduge, et nii vektori kui ka sisendi lõpp oleksid puhtad ja kahjustamata
2. Defoforiseerimine: Kontrollige, kas teie vektor on dephosphorylated, mis takistab iseligatsiooni
3. Ensüümi aktiivsus: Kontrollige, kas teie ligaas on aktiivne ja seda on kasutatud õiges temperatuuris
4. Inkubeerimise aeg: Mõned ligatsioonid saavad kasu pikemast inkubeerimisest (ööseks 16°C)
5. Puhvritingimused: Veenduge, et kasutate õiget puhvrit koos ATP-ga
6. Saasteained: Puhastage DNA, et eemaldada inhibiitorid, nagu EDTA või kõrge soola sisaldus

Kui palju vektori DNA-d peaksin ligatsioonireaktsioonis kasutama?

Tavaliselt soovitatakse kasutada 50-100 ng vektori DNA-d standardsetes ligatsioonireaktsioonides. Liigne vektori kasutamine võib põhjustada suuremat taustatööd lõikamata või iseligatud vektorite tõttu, samas kui liiga vähe võib vähendada transformatsiooni efektiivsust. Raskete ligatsioonide puhul peate võib-olla seda kogust optimeerima.

Kas peaksin arvutusi kohandama tuhmsete otste ja kleepuvate otste ligatsioonide jaoks?

Jah. Tuhmsete otste ligatsioonid on tavaliselt vähem efektiivsed kui kleepuvad (kohevused). Tuhmsete otste ligatsioonide jaoks kasutage:

• Kõrgemaid molaarseid suhteid (3:1 kuni 5:1 või isegi kõrgem)
• Rohkem T4 DNA ligaasit (tavaliselt 2-3 korda rohkem)
• Pikemaid inkubeerimisaegu
• Kaaluge PEG lisamist ligatsiooni efektiivsuse suurendamiseks

Kuidas arvutada ligatsiooni mitme sisendi jaoks?

Mitme fraktsiooni assamblee jaoks:

1. Arvutage iga sisendi kogus eraldi, kasutades sama valemit
2. Säilitage sama kogu molaarne suhe (nt kahe sisendi puhul kasutage 1.5:1.5:1 sisend1:sisend2:vektor)
3. Kohandage kogu reaktsiooni mahtu, et mahutada kõiki DNA fragmente
4. Kaaluge järjestikust ligatsiooni või kasutage mitme fraktsiooni assambleerimise meetodeid, nagu Gibsoni assamblee

Kas ma saan seda kalkulaatorit kasutada Gibsoni assamblee või Golden Gate assamblee jaoks?

See kalkulaator on spetsiaalselt loodud traditsiooniliste restriktsioonensüümi ja ligaasipõhiste kloonimiste jaoks. Gibsoni assamblee puhul soovitatakse tavaliselt kõigi fragmentide ekvimolaarsed kogused (1:1 suhe), kuigi DNA koguse arvutamine pikkuse põhjal on sarnane. Golden Gate assamblee puhul kasutatakse samuti tavaliselt ekvimolaarsed suhteid kõigi komponentide jaoks.

Kuidas arvestada vektori dephosphorylation'i oma arvutustes?

Vektori dephosphorylation (5' fosfaatrühmade eemaldamine) takistab iseligatsiooni, kuid ei muuda koguste arvutusi. Siiski, dephosphorylated vektori puhul:

1. Kasutage värsket sisendi DNA-d, millel on puhtad 5' fosfaatrühmad
2. Kaaluge veidi kõrgemate sisendi:vektori suhteid (4:1 kuni 6:1)
3. Veenduge pikemates ligatsiooniaegades (vähemalt 1 tund toatemperatuuril või öösel 16°C)

Mis on minimaalne kogu reaktsiooni maht, mida peaksin kasutama?

Minimaalne praktiline reaktsiooni maht on tavaliselt 10 μL, mis võimaldab piisavat segamist ja takistab aurustumisprobleeme. Kui teie arvutatud DNA mahud ületavad soovitud reaktsiooni mahtu, on teil mitu võimalust:

1. Kasutage kontsentreeritumaid DNA proove
2. Alandage vektori kasutatavat kogust (nt 25 ng asemel 50 ng)
3. Suurendage kogu reaktsiooni mahtu
4. Kaaluge oma DNA proovide kontsentreerimist

Kui kaua peaksin oma ligatsioonireaktsiooni inkubeerima?

Optimaalsed inkubeerimisaeg varieerub sõltuvalt ligatsiooni tüübist:

• Kleepuvate otste ligatsioonid: 1 tund toatemperatuuril (22-25°C) või 4-16 tundi 16°C
• Tuhmsete otste ligatsioonid: 2-4 tundi toatemperatuuril või üleöö (12-16 tundi) 16°C
• Kiired ligatsioonid (kasutades kõrge kontsentratsiooniga ligaasit): 5-15 minutit toatemperatuuril

Kas ma saan kasutada ülejäänud ligatsioonireaktsiooni transformatsiooniks?

Jah, ligatsioonisegud saab tavaliselt säilitada -20°C juures ja uuesti kasutada transformatsiooniks. Siiski võib iga külmutamine ja sulatamine vähendada efektiivsust. Parimate tulemuste saavutamiseks:

1. Alikvute ligatsioonisegu enne külmutamist
2. Kuumutage ligaas (65°C 10 minuti jooksul) enne ladustamist
3. Kasutage 1-2 kuu jooksul parimate tulemuste saavutamiseks

Viidatud Allikad

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/