Valgu kontsentratsiooni kalkulaator | A280 kuni mg/mL

Valgu kontsentratsiooni kalkulaator

Valgu kontsentratsiooni kalkulaator teisendab spektrofotomeetriga mõõdetud valguse neeldumise näidu lahusesse lahustunud valgu koguseks. Tulemus esitatakse tavaliselt milligrammides milliliitri kohta (mg/mL) või mikrogrammides milliliitri kohta (μg/mL). Arvutus põhineb Beer-Lamberti seadusel, keemias kasutataval seosel, mis seob proovi neelatava valguse hulga selles sisalduva aine kogusega.

Kuidas mõõdetakse valgu kontsentratsiooni

Enamik valke neelab ultraviolettvalgust tugevalt lainepikkusel 280 nanomeetrit (nm). Seda neeldumist põhjustavad peamiselt kaks valgu struktuuris leiduvat aminohapet: trüptofaan ja türosiin. Spektrofotomeeter suunab valguse läbi proovi ja mõõdab, kui palju sellest proov neelab. Seda näitu nimetatakse neelduvuseks ehk A280, kui mõõtmine toimub lainepikkusel 280 nm.

Neelduvuse mõõtmine lainepikkusel 280 nm on kiire ega hävita proovi. See eristab seda keemilistest meetoditest, nagu Bradfordi ja BCA test, mida kirjeldatakse allpool. Meetod toimib kõige paremini puhastatud valgulahuse korral, kui neelduvuse näit jääb ligikaudu vahemikku 0,1 kuni 1,0. Sellest vahemikust väljapoole jäävad näidud on vähem usaldusväärsed, mistõttu tuleb proovi sageli enne mõõtmist lahjendada.

Valgu kontsentratsiooni valem

Kalkulaator teisendab Beer-Lamberti seaduse kujule, mille abil saab leida kontsentratsiooni:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — valgu kontsentratsioon ühikutes mg/mL
• A — neelduvus lainepikkusel 280 nm (ühikuta arv)
• DF — lahjendustegur ehk mitu korda algset proovi enne mõõtmist lahjendati
• ε — ekstinktsioonikoefitsient, valgule iseloomulik konstant ühikutes L/(g·cm)
• l — optiline teepikkus ehk vahemaa, mille valgus läbib proovis, ühikutes cm (tavaliselt 1 cm standardküvetis, väikeses klaas- või plastanumas, mida kasutatakse spektrofotomeetris)

Tulemuse teisendamiseks mikrogrammideks milliliitri kohta korrutage väärtus ühikutes mg/mL arvuga 1 000. Valgu kogumassi leidmiseks proovis korrutage kontsentratsioon proovi mahuga milliliitrites.

Läbiarvutatud näide

Proovi neeldumus on lainepikkusel 280 nm 0,5. Proovi ei lahjendatud, seega on lahjendustegur 1, ning mõõtmiseks kasutati standardset 1 cm küvetti. Valk on veise seerumi albumiin (BSA), mille ekstinktsioonikoefitsient on 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

1 mL proovi korral on see ligikaudu 0,75 mg valgu kogumassi ehk 750 μg/mL.

Levinud valkude ekstinktsioonikoefitsiendid

Iga valk neelab valgust erinevalt, sest trüptofaani- ja türosiinijääkide arv on valkudes erinev. Ekstinktsioonikoefitsient kirjeldab konkreetse valgu neeldumist lainepikkusel 280 nm ühikutes L/(g·cm). Levinud väärtused on järgmised:

Kalkulaatorisse saab sisestada ka selles loendis puuduva valgu kohandatud ekstinktsioonikoefitsiendi. Teadaoleva aminohappejärjestusega valgu korral saab seda väärtust hinnata Gilli ja von Hippeli 1989 avaldatud valemi abil: ε₂₈₀ = (trüptofaanijääkide arv × 5 500) + (türosiinijääkide arv × 1 490) + (tsüstiinijääkide arv × 125). See valem annab tulemuse ühikutes M⁻¹cm⁻¹, mis on molaarsusühik ja erineb eespool toodud massipõhistest väärtustest ühikutes L/(g·cm). Tasuta tööriistad, näiteks ExPASy serveris majutatav ProtParam, arvutavad selle väärtuse otse valgujärjestuse põhjal.

Optiline teepikkus ja lahjendustegur

Optiline teepikkus on proovi sisaldava küveti laius sentimeetrites. Standardküvetid on laiusega 1 cm. Mikromahuga spektrofotomeetrid, millega mõõdetakse väga väikeseid proove, võivad kasutada palju lühemat teepikkust, näiteks 0,1 cm.

Lahjendustegur võtab arvesse enne mõõtmist tehtud lahjendamist. Kui kontsentreeritud proovi neeldumus oleks suurem kui 1,0, lahjendatakse seda tavaliselt esmalt puhverlahusega. Lahjendustegur võrdub lahjendatud kogumahu ja algse proovimahu jagatisega. Näiteks 10 μL proovi segamine 990 μL puhverlahusega annab kogumahuks 1 000 μL ja lahjendusteguriks 100.

Muud valgu kontsentratsiooni mõõtmise viisid

Neeldumus lainepikkusel 280 nm on üks mitmest laboris levinud meetodist.

• Bradfordi test: kasutab värvainet, mis muudab valguga seondudes värvi. See sobib hästi puhastamata proovidele, kuid värvimuutus võib eri valkude puhul erineda.
• BCA test: põhineb valgu peptiidsidemete põhjustatud värvimuutusel. See sobib kokku paljude detergentidega, kuid selle tegemine võtab rohkem aega kui otsene neeldumise mõõtmine.
• Lowry meetod: vanem meetod, mis on väga tundlik, kuid reageerib mõne levinud puhverlahuse koostisosaga halvasti.

Kõik need kolm meetodit hävitavad proovi. Otsene A280 mõõtmine proovi ei hävita, seega saab sama proovi säilitada ja uuesti kasutada.

Korduma kippuvad küsimused

Milline on selle meetodi ideaalne neeldumisvahemik?

Vahemikus 0,1 kuni 1,0. Alla 0,1 on näit ebatäpne. Üle 1,0 ei pruugi neeldumuse ja kontsentratsiooni vaheline seos enam olla lineaarne, mistõttu tuleb proov esmalt lahjendada.

Miks mõõta lainepikkusel 280 nm, mitte 260 nm?

Nukleiinhapped, näiteks DNA ja RNA, neelavad tugevalt lainepikkusel 260 nm. Valgud neelavad oma trüptofaani- ja türosiinisisalduse tõttu rohkem lainepikkusel 280 nm. Mõõtmine lainepikkusel 280 nm vähendab proovis leiduvate nukleiinhapete põhjustatud häireid.

Kuidas leitakse loendis puuduva valgu ekstinktsioonikoefitsient?

Teadaoleva järjestusega valgu korral arvutab selle näiteks ProtParam trüptofaani-, türosiini- ja tsüstiinijääkide arvu põhjal. Seda saab mõõta ka otse, võrreldes proovi neeldumust teadaoleva kontsentratsiooniga lahuse neeldumusega.

Kas see meetod sobib valkude segu korral?

See sobib kõige paremini ühe puhastatud valgu jaoks, mille ekstinktsioonikoefitsient on teada. Tundmatute valkude segu, näiteks rakulüsaati, mõõdetakse tavaliselt selle asemel Bradfordi või BCA testiga, sest need meetodid annavad valgu üldkogusest ühtlasema hinnangu.

Kas detergendid võivad näitu mõjutada?

Jah. Paljud detergendid neelavad valgust lainepikkuse 280 nm lähedal, mis võib tulemust moonutada. Sama detergendikontsentratsiooni sisaldava pimeproovi kasutamine aitab taustneeldumist kompenseerida. Väga suur detergendikontsentratsioon võib nõuda detergentidega sobivat testi, näiteks BCA testi.