qPCR Efekti Kalkulaator: Optimeeri Oma Kvantitatiivseid PCR Katseid

Sissejuhatus qPCR Efekti

Kvantitatiivne Polümeraasi Ahelreaktsioon (qPCR) efektiivsus on kriitiline parameeter, mis mõjutab otseselt teie qPCR katsete täpsust ja usaldusväärsust. qPCR efekti kalkulaator aitab teadlastel määrata, kui tõhusalt nende PCR reaktsioonid amplifitseerivad siht-DNA järjestusi igas termilises tsüklis. Ideaalsetes qPCR reaktsioonides peaks efektiivsus olema vahemikus 90-110%, mis näitab, et PCR toote hulk kahekordistub igas tsüklis eksponentsiaalses faasis.

Halb amplifitseerimise efektiivsus võib viia ebatäpsete kvantifitseerimise, usaldusväärsete tulemuste ja vale eksperimentaalsete järeldusteni. qPCR efektiivsuse arvutamise ja jälgimise kaudu saate optimeerida reaktsioonitingimusi, valideerida primerite disainid ja tagada oma kvantitatiivse PCR andmete kvaliteet.

See kalkulaator kasutab standardkõvera meetodit, mis joonistab tsükli läve (Ct) väärtused sihtmõõtme kontsentratsiooni logaritmi (esindatud seeriadilutsioonide kaudu) vastu, et määrata teie qPCR katse efektiivsus. Tulemuseks olev kalde väärtus seda standardkõverat kasutatakse seejärel amplifitseerimise efektiivsuse arvutamiseks lihtsa matemaatilise valemi abil.

qPCR Efektiivsus Valem ja Arvutamine

qPCR reaktsiooni efektiivsus arvutatakse standardkõvera kalde väärtusest järgmise valemi abil:

$E = 10^{(-1/slope)} - 1$

Kus:

E on efektiivsus (avaldatud kümnendmurduna)
Kalle on standardkõvera kalle (Ct väärtuste joonistamine logaritmilise lahjenduse vastu)

Ideaalse PCR reaktsiooni puhul, mille efektiivsus on 100% (täiuslik kahekordistumine ampliconide hulk igas tsüklis), oleks kalle -3.32. See on tingitud:

$10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (või 100%)}$

Efektiivsuse protsent arvutatakse, korrutades kümnendmurdude efektiivsuse 100-ga:

$\text{Efektiivsus (%)} = E \times 100\%$

Standardkõvera Mõistmine

Standardkõver luuakse, joonistades Ct väärtused (y-telg) logaritmi algse sihtmõõtme kontsentratsiooni või lahjendusteguri (x-telg) vastu. Nende muutujate vaheline suhe peaks olema lineaarne ning selle lineaarse suhte kvaliteeti hinnatakse määramiskoefitsiendi (R²) abil.

Usaldusväärsete qPCR efektiivsuse arvutuste jaoks:

R² väärtus peaks olema ≥ 0.98
Kalle peaks olema tavaliselt vahemikus -3.1 kuni -3.6
Tuleb kasutada vähemalt 3-5 lahjenduspunkte standardkõvera loomiseks

Samm-sammuline Arvutamisprotsess

Andmete ettevalmistamine: Kalkulaator võtab teie Ct väärtused iga lahjenduse punkti jaoks ja lahjendusteguri sisendina.
Logaritmiline transformatsioon: Lahjendusjärjestus muudetakse logaritmilisse skaala (logaritm alusel 10).
Lineaarne regressioon: Kalkulaator viib läbi lineaarse regressioonianalüüsi log-transformeeritud andmetel, et määrata kalle, y-intercept ja R² väärtus.
Efektiivsuse arvutamine: Kasutades kalle väärtust, arvutatakse efektiivsus valemi E = 10^(-1/slope) - 1 abil.
Tulemuste tõlgendamine: Kalkulaator kuvab efektiivsuse protsendina koos kalle ja R² väärtusega, et aidata teil hinnata oma qPCR katse usaldusväärsust.

Kuidas Kasutada qPCR Efekti Kalkulaatorit

Järgige neid samme, et arvutada oma qPCR efektiivsus:

Määrake lahjenduste arv: Valige, kui palju lahjenduspunkte teil on oma standardkõveras (soovitatav 3-7 punkti).
Sisestage lahjendustegur: Sisestage lahjendustegur, mida kasutati järjestikuste proovide vahel (nt 10 10-kordse lahjenduse seeria jaoks, 5 5-kordse lahjenduse seeria jaoks).
Sisestage Ct väärtused: Sisestage Ct väärtused iga lahjenduspunkte jaoks. Tavaliselt sisaldab esimene lahjendus (Lahjendus 1) kõige kõrgemat kontsentratsiooni sihtmõõtme, mis toob kaasa madalaima Ct väärtuse.
Vaadake tulemusi: Kalkulaator arvutab automaatselt ja kuvab:
- PCR efektiivsus (%)
- Standardkõvera kalle
- Y-intercept
- R² väärtus (määramiskoefitsient)
- Visuaalne esitus standardkõverast
Tõlgendage tulemusi: Hinnake, kas teie qPCR efektiivsus jääb vastuvõetavasse vahemikku (90-110%) ja kas R² väärtus näitab usaldusväärset standardkõverat (≥ 0.98).
Kopeerige tulemused: Kasutage nuppu "Kopeeri tulemused", et kopeerida kõik arvutatud väärtused oma dokumentide või publikatsioonide jaoks.

Näide Arvutamisest

Vaatame näidet:

Lahjendustegur: 10 (10-kordne seeriline lahjendus)
Lahjenduste arv: 5
Ct väärtused:
- Lahjendus 1 (kõrgeim kontsentratsioon): 15.0
- Lahjendus 2: 18.5
- Lahjendus 3: 22.0
- Lahjendus 4: 25.5
- Lahjendus 5 (madalaim kontsentratsioon): 29.0

Kui joonistada standardkõver:

X-telg esindab log(lahjendus): 0, 1, 2, 3, 4
Y-telg esindab Ct väärtusi: 15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0

Kalkulaator viib läbi lineaarse regressiooni ja määrab:

Kalle: -3.5
Y-intercept: 15.0
R²: 1.0 (täiuslik lineaarne suhe selle näite puhul)

Kasutades efektiivsuse valemit: $E = 10^{(-1/-3.5)} - 1 = 10^{0.286} - 1 = 0.93 \text{ või } 93\%$

See näitab head qPCR efektiivsust 93%, mis jääb vastuvõetavasse vahemikku 90-110%.

Kasutuskohad qPCR Efektiivsuse Arvutamiseks

1. Primerite Valideerimine ja Optimeerimine

Enne uue primeripaari kasutamist kvantitatiivsetes katsetes on oluline selle jõudluse valideerimine. qPCR efektiivsuse arvutamine aitab:

Hinnata primerite spetsiifilisust ja jõudlust
Optimeerida primerite kontsentratsioone
Määrata optimaalne annealing temperatuur
Valideerida primeripaare erinevates sihtmõõtme kontsentratsioonides

2. Katse Arendamine ja Valideerimine

Uute qPCR katsete väljatöötamisel on efektiivsuse arvutamine kriitilise tähtsusega:

Tagada usaldusväärne kvantifitseerimine kogu dünaamilises vahemikus
Valideerida avastamise alumine piirmäär
Kinnitada katse reprodutseeritavust
Võrrelda erinevaid avastamiskeemiaid (SYBR Green vs. TaqMan proovid)

3. Geenide Ekspressiooni Uuringud

Suhteliste kvantifitseerimise katsetes on PCR efektiivsuse teadmine hädavajalik:

Rakendada sobivaid kvantifitseerimise mudeleid (ΔΔCt vs. efektiivsuse korrektsiooniga mudelid)
Normaliseerida sihtgeenid viidetegeenide suhtes, mille efektiivsus on erinev
Tagada täpsed korduvuse arvutused
Valideerida tulemusi erinevates eksperimentaalsetes tingimustes

4. Diagnostika ja Kliinilised Rakendused

Kliinilistes ja diagnostilistes seadmetes on qPCR efektiivsus oluline:

Valideerida diagnostikakatseid enne kliinilist rakendamist
Tagada järjepidev jõudlus erinevate proovide tüüpide vahel
Täita regulatiivseid nõudeid katse valideerimise osas
Jälgida kvaliteedikontrolli rutiinsel testimisel

5. Keskkonna- ja Toidutestimine

Keskkonna- ja toiduohutuse rakendustes aitavad efektiivsuse arvutused:

Valideerida patogeenide või GMOde avastamismeetodeid
Tagada järjepidev jõudlus keerulistes proovimatriksites
Määrata avastamise piirmäärad keerulistes proovides
Vastata testimise standarditele ja regulatsioonidele

Alternatiivid Standardkõvera Meetodile

Kuigi standardkõvera meetod on kõige levinum lähenemine qPCR efektiivsuse arvutamiseks, on olemas ka alternatiivsed meetodid:

1. Ühe Ampliconi Efektiivsuse Analüüs

See meetod arvutab efektiivsuse ühe amplifikatsiooni kõvera fluoresentsandmete põhjal, ilma et oleks vaja lahjendusseeriat. Sellised tarkvarad nagu LinRegPCR analüüsivad individuaalsete reaktsioonide eksponentsiaalset faasi, et määrata efektiivsus.

Eelised:

Pole vaja lahjendusseeriat
Saab arvutada efektiivsuse iga individuaalse reaktsiooni jaoks
Kasulik, kui proovimaterjal on piiratud

Puudused:

Võib olla vähem täpne kui standardkõvera meetod
Nõuab analüüsimiseks spetsiaalset tarkvara
Tundlikum taustfluorestsentsi probleemide suhtes

2. Absoluutne Kvantifitseerimine Digitaalsete PCR-idega

Digitaalne PCR (dPCR) pakub absoluutset kvantifitseerimist ilma, et oleks vaja standardkõverat või efektiivsuse arvutamist.

Eelised:

Pole vaja efektiivsuse arvutamist
Suurem täpsus madala kontsentratsiooniga sihtmõõtmete jaoks
Vähem mõjutatud inhibiitoritest

Puudused:

Nõuab spetsiaalset varustust
Kõrgem kulu proovi kohta
Piiratud dünaamiline vahemik võrreldes qPCR-iga

3. Suhtelised Kvantifitseerimise Meetodid

Mõned qPCR analüüsi tarkvarad pakuvad suhtelise kvantifitseerimise meetodeid, mis hindavad efektiivsust ilma täieliku standardkõverata.

Eelised:

Nõuab vähem proove kui täielik standardkõver
Saab teostada koos eksperimentaalsete proovidega
Kasulik rutiinse analüüsi jaoks

Puudused:

Võib olla vähem täpne kui täielik standardkõver
Piiratud lineaarse dünaamilise vahemiku valideerimine
Ei pruugi tuvastada inhibeerimise probleeme

qPCR ja Efektiivsuse Arvutamise Ajalugu

qPCR ja efektiivsuse arvutamise areng on viimase paarikümne aasta jooksul oluliselt arenenud:

Varajane Areng (1980ndad-1990ndad)

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) leiutas Kary Mullis 1983. aastal, revolutsioneerides molekulaarbioloogiat. Siiski oli traditsiooniline PCR ainult kvalitatiivne või poolkvantitatiivne. Esimene reaalajas PCR süsteem töötati välja 1990ndate alguses Russell Higuchi ja tema kolleegide poolt, kes näitasid, et PCR toodete jälgimine nende akumuleerumise ajal (kasutades etidiiumbromiidi fluorescentsust) võiks anda kvantitatiivset teavet.

qPCR Standardite Kehtestamine (1990ndad-2000ndad)

Kuna qPCR tehnoloogia arenes, tunnustasid teadlased standardiseerimise ja valideerimise tähtsust. PCR efektiivsuse kontseptsioonist sai usaldusväärse kvantifitseerimise keskne element:

1. aastal tutvustas Pfaffl efektiivsuse korrektsiooniga kvantifitseerimise mudeleid
Standardkõvera meetod efektiivsuse arvutamiseks sai laialdaselt kasutusele
Ilmusid kaubanduslikud qPCR süsteemid, millel on paranenud avastamiskeemiad

Kaasaegsed Arengud (2000ndad-Käesolev)

Valdkond on jätkuvalt arenenud:

MIQE juhiste (Minimaalsed Teabe Nõuded Kvantitatiivsete Reaalajas PCR Katsete Avaldamiseks) avaldamine 2009. aastal, rõhutades PCR efektiivsuse aruandmise tähtsust
Arendatud on täiustatud analüüsitarkvara efektiivsuse arvutamiseks
Efektiivsuse arvutamine on integreeritud qPCR seadmete ja tarkvara
Digitaalne PCR on tekkinud täiendava tehnoloogiana

Täna peetakse qPCR efektiivsuse arvutamist ja aruandlust hädavajalikuks usaldusväärsete qPCR andmete avaldamiseks ning sellised tööriistad nagu see kalkulaator aitavad teadlastel järgida parimaid praktikaid valdkonnas.

Koodinäited qPCR Efektiivsuse Arvutamiseks

Excel

1' Exceli valem qPCR efektiivsuse arvutamiseks kalde põhjal
2' Asetage rakkude B2, kui kalle on rakus A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Exceli valem efektiivsuse protsendiks muutmiseks
6' Asetage rakkude C2, kui efektiivsuse kümnendmurd on rakus B2
7=B2*100
8
9' Funktsioon efektiivsuse arvutamiseks Ct väärtustest ja lahjendustegurist
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11    Dim i As Integer
12    Dim n As Integer
13    Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14    Dim logDilution As Double, slope As Double
15    
16    n = CtValues.Count
17    
18    ' Arvutage lineaarne regressioon
19    For i = 1 To n
20        logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21        sumX = sumX + logDilution
22        sumY = sumY + CtValues(i)
23        sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24        sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25    Next i
26    
27    ' Arvutage kalle
28    slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29    
30    ' Arvutage efektiivsus
31    qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
33

R

1# R funktsioon qPCR efektiivsuse arvutamiseks Ct väärtustest ja lahjendustegurist
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3  # Looge log lahjenduse väärtused
4  log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5  
6  # Viige läbi lineaarne regressioon
7  model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8  
9  # Tõmmake kalle ja R-ruut
10  slope <- coef(model)[2]
11  r_squared <- summary(model)$r.squared
12  
13  # Arvutage efektiivsus
14  efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15  
16  # Tagastage tulemused
17  return(list(
18    efficiency = efficiency,
19    slope = slope,
20    r_squared = r_squared,
21    intercept = coef(model)[1]
22  ))
23}
24
25# Näide kasutamisest
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektiivsus: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Kalle: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-ruut: %.4f\n", results$r_squared))
32

Python

1import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6    """
7    Arvutage qPCR efektiivsus Ct väärtustest ja lahjendustegurist.
8    
9    Parameetrid:
10    ct_values (list): Ct väärtuste loend
11    dilution_factor (float): Lahjendustegur järjestikuste proovide vahel
12    
13    Tagastab:
14    dict: Sõnastik, mis sisaldab efektiivsust, kalde, r_squared ja y-intercept
15    """
16    # Looge log lahjenduse väärtused
17    log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18    
19    # Viige läbi lineaarne regressioon
20    slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21    
22    # Arvutage efektiivsus
23    efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24    r_squared = r_value ** 2
25    
26    return {
27        'efficiency': efficiency,
28        'slope': slope,
29        'r_squared': r_squared,
30        'intercept': intercept
31    }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34    """
35    Joonistage standardkõver koos regressioonijoontega.
36    """
37    log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38    
39    plt.figure(figsize=(10, 6))
40    plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41    
42    # Looge punktid regressioonijoonte jaoks
43    x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44    y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45    plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46    
47    plt.xlabel('Log Lahjendus')
48    plt.ylabel('Ct Väärtus')
49    plt.title('qPCR Standardkõver')
50    
51    # Lisage võrrand ja R² ploti
52    equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53    r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54    efficiency = f"Efektiivsus = {results['efficiency']:.2f}%"
55    
56    plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57    plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58    plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59    
60    plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61    plt.tight_layout()
62    plt.show()
63
64# Näide kasutamisest
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektiivsus: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Kalle: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-ruut: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Joonistage standardkõver
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
76

JavaScript

1/**
2 * Arvutage qPCR efektiivsus Ct väärtustest ja lahjendustegurist
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct väärtuste massiiv
4 * @param {number} dilutionFactor - Lahjendustegur järjestikuste proovide vahel
5 * @returns {Object} Objekt, mis sisaldab efektiivsust, kalde, rSquared ja y-intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8  // Looge log lahjenduse väärtused
9  const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10  
11  // Arvutage lineaarse regressiooni keskmised
12  const n = ctValues.length;
13  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14  
15  for (let i = 0; i < n; i++) {
16    sumX += logDilutions[i];
17    sumY += ctValues[i];
18    sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19    sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20    sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21  }
22  
23  // Arvutage kalle ja y-intercept
24  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26  
27  // Arvutage R-ruut
28  const yMean = sumY / n;
29  let totalVariation = 0;
30  let explainedVariation = 0;
31  
32  for (let i = 0; i < n; i++) {
33    const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34    totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35    explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36  }
37  
38  const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39  
40  // Arvutage efektiivsus
41  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42  
43  return {
44    efficiency,
45    slope,
46    rSquared,
47    intercept
48  };
49}
50
51// Näide kasutamisest
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektiivsus: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Kalle: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-ruut: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60

Korduma Kippuvad Küsimused (KKK)

Mis on hea qPCR efektiivsuse protsent?

Hea qPCR efektiivsus jääb tavaliselt vahemikku 90% kuni 110% (0.9-1.1). Efektiivsus 100% esindab täiuslikku kahekordistumist PCR tootest igas tsüklis. Efektiivsused väljaspool seda vahemikku võivad viidata probleemidele primerite disainis, reaktsioonitingimustes või inhibiitorite olemasolus.

Miks on minu qPCR efektiivsus suurem kui 100%?

Efektiivsused, mis ületavad 100%, võivad tekkida:

Lahjendusseeria pipeteerimise vigade tõttu
PCR inhibiitorite olemasolu, mis mõjutavad kõrgemaid kontsentratsioone rohkem kui madalamaid
Mittespetsiifiline amplifitseerimine või primer-dimerid, mis aitavad signaalile
Probleemid baasilise korrektsiooniga qPCR analüüsis

Mida madal R² väärtus minu standardkõveras näitab?

Madala R² väärtuse (alla 0.98) puhul viitab see halvale lineaarusele teie standardkõveras, mis võib olla põhjustatud:

Lahjendusseeria ettevalmistamise pipeteerimise vigadest
Kontsentratsiooni vahemikus ebaühtlasest amplifitseerimisest
Tuvastamise piiride saavutamisest väga madalate või kõrgete kontsentratsioonide korral
PCR inhibeerimisest, mis mõjutab mõningaid lahjenduspunkte rohkem kui teisi
Halvast primerite jõudlusest või mittespetsiifilisest amplifitseerimisest

Kui palju lahjenduspunkte peaksin ma qPCR efektiivsuse arvutamiseks kasutama?

Usaldusväärsete efektiivsuse arvutuste jaoks on vajalik vähemalt 3 lahjenduspunkte, kuid 5-6 punkti on soovitatavad täpsemate tulemuste saamiseks. Need punktid peaksid katma kogu oodatava sihtmõõtme kontsentratsiooni dünaamilise vahemiku teie eksperimentaalsetes proovides.

Kuidas qPCR efektiivsus mõjutab suhtelisi kvantifitseerimise arvutusi?

Suhteliste kvantifitseerimise katsetes, kasutades ΔΔCt meetodit, eeldatakse, et siht- ja viidetegeenide vahel on võrdsed efektiivsused (ideaalis 100%). Kui efektiivsused erinevad oluliselt:

Tavaline ΔΔCt meetod võib viia märkimisväärsete kvantifitseerimise vigadeni
Tuleb kasutada efektiivsuse korrektsiooniga kvantifitseerimise mudeleid (nt Pfaffli meetod)
Veateade suureneb suuremate Ct erinevuste korral proovide vahel

Kas ma saan kasutada sama efektiivsuse väärtust kõigi oma qPCR katsete jaoks?

Ei, efektiivsust tuleks määrata iga primeripaari jaoks ja tuleks uuesti valideerida:

Uute primerite partiide kasutamisel
Reaktsioonitingimuste või master mixi muutmisel
Erinevate proovide tüüpide või ekstraktsioonimeetodite kasutamisel
Aeg-ajalt kvaliteedikontrolli osana

Kuidas PCR inhibiitorid mõjutavad efektiivsuse arvutusi?

PCR inhibiitorid võivad:

Vähendada üldist efektiivsust
Mõjutada kõrgemaid kontsentratsiooniproove tõsisemalt
Luua mittelineaarsust standardkõveras
Viia sihtmõõtme alahindamiseni
Põhjustada ebaühtlust amplifitseerimises replikatsioonide vahel

Mis vahe on qPCR efektiivsusel ja PCR efektiivsusel?

Termineid kasutatakse sageli vaheldumisi, kuid:

qPCR efektiivsus viitab konkreetselt reaalajas kvantitatiivse PCR-i mõõdetud efektiivsusele
PCR efektiivsus võib viidata üldisele kontseptsioonile mis tahes PCR reaktsioonis
qPCR efektiivsust mõõdetakse kvantitatiivselt kasutades standardkõveraid või muid meetodeid
Traditsioonilise PCR efektiivsust hinnatakse sageli kvalitatiivselt geelelektroforeesi abil

Kuidas ma saan parandada oma qPCR efektiivsust?

qPCR efektiivsuse parandamiseks:

Optimeerige primerite disain (18-22 bp pikkus, 50-60% GC sisu, Tm umbes 60°C)
Testige erinevaid annealing temperatuure
Optimeerige primerite kontsentratsioone
Kasutage kvaliteetset DNA/RNA sihtmõõtme
Kaaluge PCR tugevdajate kasutamist keeruliste sihtmõõtmete jaoks
Tagage õige proovide ettevalmistamine, et eemaldada potentsiaalsed inhibiitorid
Testige erinevaid kaubanduslikke master mix'e

Kas ma saan võrrelda proove, millel on erinevad efektiivsused?

Erineva efektiivsusega proovide võrdlemine ei ole soovitatav, kuna:

See võib viia märkimisväärsete kvantifitseerimise vigadeni
Veateade suureneb suuremate Ct erinevuste korral
Kui vältimatu, tuleb kasutada efektiivsuse korrektsiooniga kvantifitseerimise mudeleid
Tulemusi tuleks tõlgendada ettevaatlikult ja lisavalideerimisega

Viidatud Allikad

Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE juhised: minimaalsed teabe nõuded kvantitatiivsete reaalajas PCR katsete avaldamiseks. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Uus matemaatiline mudel suhteliseks kvantifitseerimiseks reaalajas RT-PCR-is. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kui hea on PCR efektiivsuse hinnang: soovitused täpsete ja usaldusväärsete qPCR efektiivsuse hindamiste jaoks. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Lõplik qPCR katse: avaldamiskvaliteediga, reprodutseeritavate andmete tootmine esimesel korral. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifitseerimise efektiivsus: seostamine baasilise ja kallutatuse vahel kvantitatiivsete PCR andmete analüüsimisel. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kineetiline PCR analüüs: reaalajas DNA amplifikatsiooni reaktsioonide jälgimine. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Reaalajas PCR Rakenduste Juhend. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Reaalajas PCR Käsiraamat. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf

Meie qPCR Efekti Kalkulaator pakub teadlastele lihtsat, kuid võimsat tööriista oma kvantitatiivsete PCR katsete valideerimiseks ja optimeerimiseks. Arvutades täpselt efektiivsuse standardkõverate põhjal, saate tagada usaldusväärse kvantifitseerimise, lahendada probleemseid katseid ja järgida parimaid praktikaid qPCR katsetes.

Proovige meie kalkulaatorit juba täna, et parandada oma qPCR andmete kvaliteeti ja usaldusväärsust!

qPCR efektiivsuse kalkulaator: analüüsi standardkõveraid ja amplifikatsiooni

qPCR efekti kalkulaator

Sisendparameetrid

Ct väärtused

Tulemused

Standardsuurus

Teave

Dokumentatsioon

qPCR Efekti Kalkulaator: Optimeeri Oma Kvantitatiivseid PCR Katseid

Sissejuhatus qPCR Efekti

qPCR Efektiivsus Valem ja Arvutamine

Standardkõvera Mõistmine

Samm-sammuline Arvutamisprotsess

Kuidas Kasutada qPCR Efekti Kalkulaatorit

Näide Arvutamisest

Kasutuskohad qPCR Efektiivsuse Arvutamiseks

1. Primerite Valideerimine ja Optimeerimine

2. Katse Arendamine ja Valideerimine

3. Geenide Ekspressiooni Uuringud

4. Diagnostika ja Kliinilised Rakendused

5. Keskkonna- ja Toidutestimine

Alternatiivid Standardkõvera Meetodile

1. Ühe Ampliconi Efektiivsuse Analüüs

2. Absoluutne Kvantifitseerimine Digitaalsete PCR-idega

3. Suhtelised Kvantifitseerimise Meetodid

qPCR ja Efektiivsuse Arvutamise Ajalugu

Varajane Areng (1980ndad-1990ndad)

qPCR Standardite Kehtestamine (1990ndad-2000ndad)

Kaasaegsed Arengud (2000ndad-Käesolev)

Koodinäited qPCR Efektiivsuse Arvutamiseks

Excel

R

Python

JavaScript

Korduma Kippuvad Küsimused (KKK)

Mis on hea qPCR efektiivsuse protsent?

Miks on minu qPCR efektiivsus suurem kui 100%?

Mida madal R² väärtus minu standardkõveras näitab?

Kui palju lahjenduspunkte peaksin ma qPCR efektiivsuse arvutamiseks kasutama?

Kuidas qPCR efektiivsus mõjutab suhtelisi kvantifitseerimise arvutusi?

Kas ma saan kasutada sama efektiivsuse väärtust kõigi oma qPCR katsete jaoks?

Kuidas PCR inhibiitorid mõjutavad efektiivsuse arvutusi?

Mis vahe on qPCR efektiivsusel ja PCR efektiivsusel?

Kuidas ma saan parandada oma qPCR efektiivsust?

Kas ma saan võrrelda proove, millel on erinevad efektiivsused?

Viidatud Allikad

Seotud tööriistad

Seriaalne lahjendus kalkulaator laboratoorses ja teaduslikus kasutuses

Keemilise Reaktsiooni Suhtarv Kalkulaator Tasakaalu Analüüsiks

DNA ligatsiooni kalkulaator molekulaarkloonimise katseteks

Kp väärtuse kalkulaator keemiliste tasakaalureaktsioonide jaoks

Rekonstruktsiooni kalkulaator: määrake pulbrite vedeliku maht

pKa väärtuse kalkulaator: leida happe dissotsiatsioonikonstandid

Efusioonimäärade kalkulaator: võrrelge gaasi efusiooni Graham'i seadusega

pH väärtuse kalkulaator: muuda vesinikioonide kontsentratsioon pH-ks

DNA kontsentratsiooni kalkulaator: Muuda A260 ng/μL-ks

Komposti Kalkulaator: Leia Oma Täiuslik Orgaaniliste Materjalide Segamis Suhe