qPCR efektiivsuse kalkulaator: Standardkõvera analüüsi tööriist

qPCR-i efektiivsuse kalkulaator

qPCR-i efektiivsuse kalkulaator hindab, kui hästi kvantitatiivse PCR-i (qPCR-i) reaktsioon siht-DNA järjestust iga amplifikatsioonitsükli jooksul kopeerib. See kasutab lahjendusseeria Ct-väärtusi (tsükli number, mille juures fluorestsentssignaal ületab määratud läviväärtuse), et arvutada efektiivsus, tõus, vabaliige ja R².

Mis on qPCR-i efektiivsus?

Kvantitatiivne PCR jälgib fluorestsentsi reaktsiooni käigus, mil siht-DNA järjestust tsüklite kaupa kopeeritakse. Amplifikatsiooni efektiivsus kirjeldab, kui palju siht-DNA kogus iga tsükli jooksul suureneb. Efektiivsuse 100% korral siht-DNA kogus iga tsükliga kahekordistub.

Tegelikud reaktsioonid saavutavad täpselt 100% harva. Enamik laboreid peab usaldusväärse kvantifitseerimise jaoks vastuvõetavaks efektiivsust vahemikus 90% kuni 110%. Väärtus alla 90% või üle 110% viitab probleemile, näiteks praimerite halvale disainile, proovi ekstraheerimisel kaasa kandunud PCR-i inhibiitoritele või lahjendusseeria pipeteerimisvigadele.

Efektiivsus on kõige olulisem proovidevahelise geeniekspressiooni võrdlemisel. Levinud ΔΔCt-meetod suhtelise muutuse arvutamiseks eeldab, et iga reaktsioon toimub efektiivsusega 100%. Kui mõõdetud efektiivsus erineb väärtusest 100% või kui sihtgeenil ja referentsgeenil on erinev efektiivsus, võivad suhtelise muutuse tulemused olla ebatäpsed.

qPCR-i efektiivsuse valem

Efektiivsus arvutatakse standardkõvera tõusu põhjal. Standardkõver saadakse, kui lahjendusseerias olevate lähtematerjali DNA koguste logaritmi alusega 10 (log10) vastavad Ct-väärtused graafikule kantakse ja punktidele sirge sobitatakse.

E = 10^(-1/tõus) - 1

E on efektiivsus kümnendmurruna (protsendi saamiseks korrutage väärtusega 100). Tõus on standardkõvera sirge tõus. See on negatiivne, sest Ct suureneb lähte-DNA koguse vähenemisel.

Tõus -3,32 vastab efektiivsusele 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

See tuleneb sellest, et 10-kordne lahjendus peaks nihutama Ct-d ligikaudu 3,32 tsükli võrra, kui reaktsioonis DNA kogus iga tsükliga kahekordistub, sest log2(10) on ligikaudu 3,32.

Praktikas peetakse vastuvõetavaks tõusu vahemikus -3,1 kuni -3,6. See vahemik vastab ligikaudu efektiivsusele 90% kuni 110%. Väärtusele -3,1 lähedasem tõus annab suurema arvutatud efektiivsuse; väärtusele -3,6 lähedasem tõus annab väiksema efektiivsuse.

Kuidas arvutada qPCR-i efektiivsust: standardkõvera meetod

1. Valmistage ette lahjendusseeria. Alustage kõige kontsentreeritumast proovist ja lahjendage iga järgmist proovi kindla teguriga, tavaliselt 10-kordselt. Tehke qPCR iga lahjendusega ja registreerige selle Ct-väärtus.
2. Teisendage iga lahjendus log10-väärtuseks. Võttes esimese, kõige kontsentreerituma proovi positsiooniks 0, on proovi number i log10-suhteline kogus võrdne väärtusega -i × log10(lahjendustegur).
3. Kandke iga lahjenduse Ct (vertikaalteljele) graafikule log10-väärtuse suhtes (horisontaalteljel) ja tehke lineaarne regressioon.
4. Lugege regressioonisirge tõus, vabaliige ja R².
5. Asendage tõus valemis E = 10^(-1/tõus) - 1, et saada efektiivsus.

Standardkõvera kvaliteedikriteeriumid

• R² vähemalt 0,98. See näitab, kui hästi punktid sirgele sobituvad. Väiksem väärtus viitab sageli pipeteerimisvigadele või ebaühtlasele amplifikatsioonile.
• Tõus vahemikus -3,1 kuni -3,6. See vahemik vastab efektiivsusele 90–110%.
• Vähemalt kolm lahjenduspunkti. Viis või kuus punkti annavad usaldusväärsema sirge ja hõlbustavad erindi märkamist.
• Kõige kontsentreerituma proovi Ct peaks olema ligikaudu 15-20. Kõige lahjem proov peaks jääma allapoole Ct väärtust 35, sest sellest suuremad väärtused lähenevad avastamispiirile.

Näidisarvutus

Viie punktiga 10-kordne lahjendusseeria annab järgmised Ct-väärtused kõige kontsentreeritumast kõige lahjemani: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Log10-suhtelise koguse väärtused on 0, -1, -2, -3, -4, sest iga lahjendusetapp lisab väärtuse -log10(10), ehk -1. Ct suureneb igal etapil 3,5 tsükli võrra, mistõttu punktid paiknevad sirgel ja lineaarne regressioon annab:

• Tõus: -3,5
• Vabaliige: 15,0
• R²: 1,0

Efektiivsus: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931 ehk ligikaudu 93%.

Efektiivsus 93% koos väärtusega R² = 1,0 vastab standardsetele kvaliteedikriteeriumidele ja sobib geeniekspressiooni kvantifitseerimiseks.

Koodinäide

See JavaScripti funktsioon kasutab sama meetodit nagu kalkulaator. Iga Ct-väärtuse indeks muudetakse enne logaritmi võtmist vastandmärgiliseks, sest esimesel, kõige kontsentreeritumal proovil on suurim suhteline kogus ja iga järgmine proov on lahjem.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Miks on efektiivsus geeniekspressiooni puhul oluline?

Suhtelise muutuse arvutused, sealhulgas ΔΔCt-meetod, eeldavad, et iga reaktsioon kahekordistab oma sihtmärgi iga tsükli jooksul. Kui sihtgeenil ja referentsgeenil on erinev mõõdetud efektiivsus, tekitab lihtne ΔΔCt-valem vea. Efektiivsuste erinedes rohkem kui ligikaudu viis protsendipunkti lähevad teadlased sageli üle efektiivsust korrigeerivale arvutusele, näiteks Michael Pfaffli 2001. aastal kirjeldatud meetodile. MIQE suunised, 2009. aastal avaldatud ja laialt viidatud qPCR-i aruandlusstandardite kogum, soovitavad uuringutes koos kvantifitseerimistulemustega esitada arvutatud efektiivsuse, tõusu ja R².

Korduma kippuvad küsimused

Milline qPCR-i efektiivsuse protsent on hea?

Üldiselt peetakse vastuvõetavaks vahemikku 90% kuni 110%, hästi optimeeritud analüüsid annavad tavaliselt tulemuse umbes 95–105%. Tõus -3,32 vastab täpselt efektiivsusele 100%.

Miks on minu qPCR-i efektiivsus üle 110%?

Levinud põhjused on lahjendusseeria pipeteerimisvead, praimeridimeerid, inhibiitorid, mis mõjutavad kontsentreeritud ja lahjendatud proove erinevalt, või amplifikatsiooni eksponentsiaalsest faasist väljapoole seatud fluorestsentsi läviväärtus. Rohkem kui ühe tipuga sulamiskõver võib viidata praimeridimeeridele.

Miks on minu qPCR-i efektiivsus alla 90%?

Tõenäolised põhjused on praimerite halb disain, proovi ekstraheerimisel kaasa kandunud PCR-i inhibiitorid või ebasobiv annealing-temperatuur. Praimerite spetsiifilisuse kontrollimine ja temperatuurigradiendi kasutamine võivad aidata põhjust leida.

Mida tähendab väike R² väärtus?

R² näitab, kui hästi Ct-väärtused sobituvad logaritmilise koguse suhtes sirgele. Väärtus alla 0,98 viitab pipeteerimise ebaühtlusele, inhibeeritud proovile või avastamispiiri lähedal olevale lahjenduspunktile.

Mitu lahjenduspunkti standardkõver vajab?

Vähemalt kolm, mis on lineaarse regressiooni tegemiseks vajalik miinimum. Viis või kuus punkti annavad usaldusväärsema tõusu ja hõlbustavad erindite märkamist.

Kas efektiivsus võib katsete vahel muutuda?

Jah. Uus reaktiivipartii, uus praimeripartii, teistsugune proovitüüp või erinev qPCR-i instrument võib efektiivsust muuta. Paljud laborid kontrollivad efektiivsust uuesti iga paari kuu järel või iga uue reaktiivipartiiga.

Viited

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA jt. MIQE suunised: kvantitatiivse reaalaja-PCR-i katsete avaldamiseks vajalik miinimumteave. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Uus matemaatiline mudel suhteliseks kvantifitseerimiseks reaalaja RT-PCR-is. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kui täpne on PCR-i efektiivsuse hinnang: soovitused qPCR-i efektiivsuse täpseks ja usaldusväärseks hindamiseks. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.