Kalibreerimiskõvera Kalkulaator | Lineaarne Regressioon Laborianalüüsiks

Mis on kalibreerimiskõvera kalkulaator

Kalibreerimiskõvera kalkulaator teisendab mõõteriista näidud kontsentratsioonideks. Selleks sobitab see teadaoleva kontsentratsiooniga standardite andmepunktide kaudu sirge ning kasutab seda sirget uue näidu kontsentratsiooniks teisendamiseks. Laborid kasutavad kalibreerimiskõveraid keemias, bioloogias ja keskkonnauuringutes alati, kui mõõteriist annab kontsentratsiooni asemel signaali, näiteks neeldumise või piigi pindala.

Sellel lehel olev kalkulaator sobitab sirge lineaarse regressiooni ehk vähimruutude meetodi abil. See annab kalde, vabaliikme ja R² väärtuse, mis näitab, kui täpselt punktid sirgele vastavad. Seejärel saab kalkulaator mõõdetud vastuse põhjal hinnata tundmatu proovi kontsentratsiooni.

Kalibreerimiskõvera valem

Kalibreerimiskõver eeldab kontsentratsiooni ja mõõteriista vastuse vahelist lineaarset seost:

$y = mx + b$

• $y$ on vastus ehk see, mida mõõteriist mõõdab
• $x$ on kontsentratsioon
• $m$ on kalle
• $b$ on y-telje lõikepunkt

Kalde ja vabaliikme arvutamine

$n$ punktist koosneva hulga korral on andmetega kõige paremini sobivad kalle ja vabaliige (vähimruutude mõttes) järgmised:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Siin on $\bar{x}$ ja $\bar{y}$ kõigi punktide keskmine kontsentratsioon ja keskmine vastus.

R² valem

R² ehk determinatsioonikordaja näitab, kui hästi sirge andmetega sobib:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ on vastus, mida sirge iga $x_i$ korral ennustab. R² väärtus jääb vahemikku 0 kuni 1. Väärtus 1 tähendab, et iga punkt asub täpselt sirgel.

Tundmatu kontsentratsiooni valem

Kui kalle ja vabaliige on teada, saab mõõdetud vastuse $y$ kontsentratsiooniks tagasi teisendada:

$x = \frac{y - b}{m}$

Kui selle arvutuse tulemus on negatiivne, esitab kalkulaator kontsentratsioonina 0, sest negatiivsel kontsentratsioonil puudub füüsikaline tähendus. Samuti esitab see 0, kui sobitatud kalle on 0, sest horisontaalne sirge ei anna kontsentratsiooni kohta teavet.

Näidisarvutus

Oletame, et neli standardit annavad järgmised tulemused:

Keskmine kontsentratsioon on 3 ja keskmine vastus on 0,20.

Kalle:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Vabaliige:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: prognoositud vastuste võrdlemisel tegelike vastustega saadakse R² = 0,9966.

Sobitatud sirge on:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Oletame nüüd, et tundmatu proovi vastus on 0,20. Selle kontsentratsioon on:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Kuidas seda kalkulaatorit kasutada

1. Sisestage iga standardi teadaolev kontsentratsioon ja mõõdetud vastus arvupaarina. Kalkulaator alustab kahe reaga.
2. Valige „Andmepunkti lisamine“, et sisestada rohkem standardeid, või rea kõrval „Andmepunkti eemaldamine“, et see kustutada. Vaja on vähemalt kahte punkti.
3. Kui vähemalt kaks punkti on täidetud, kuvab kalkulaator regressioonivõrrandi, R² väärtuse ning punktide ja sobitatud sirge graafiku. Kalle, vabaliige, R² ja kontsentratsioon ümardatakse kuvamisel nelja kümnendkohani.
4. Sisestage mõõdetud vastus jaotisse „Tundmatu kontsentratsiooni arvutamine“, et näha sellele vastavat kontsentratsiooni. Väärtuse sisestamise ajal uueneb tulemus automaatselt; eraldi nuppu ei ole vaja vajutada.
5. Valige „Lähtesta“, et kustutada kõik sisestatud punktid ja vastuseväli ning alustada uuesti.

Kalde, vabaliikme ja R² tõlgendamine

Kalle näitab, kui palju vastus kontsentratsiooniühiku kohta muutub. Suurem kalle tähendab, et meetod reageerib väikestele kontsentratsioonimuutustele tugevamalt.

Vabaliige on nullkontsentratsiooni korral prognoositud vastus. See kajastab taustsignaali, näiteks tühiproovi või mõõteriista baasjoont. Nullist erinev vabaliige on tavaline ega ole iseenesest probleem, kuid suur või kalibreerimiste vahel muutuv vabaliige võib viidata saastumisele või mõõteriista rikkele.

R² näitab, kui täpselt punktid sirgele vastavad. Hästi toimiva lineaarse meetodi korral on väärtused üle 0,99 tüüpilised. Väiksem R² võib tähendada pipeteerimisviga, riknenud standardit või kontsentratsioonivahemikku, milles vastus ei ole enam lineaarne.

Kus kalibreerimiskõveraid kasutatakse

Kalibreerimiskõverad on tavalised kõikjal, kus mõõteriista toorsignaal tuleb teisendada kontsentratsiooniks:

• Spektrofotomeetria — mõõdetakse valguse neeldumist ja teisendatakse see kontsentratsiooniks, näiteks valgu- või pigmendisisalduse määramisel.
• Kromatograafia (HPLC, GC) — kromatogrammi piigi pindala või kõrgus teisendatakse kontsentratsiooniks; seda kasutatakse sageli ravimite analüüsis ja keskkonnauuringutes.
• ELISA ja muud immunoanalüüsid — mikroplaadilugeja mõõdetud värvuse või fluorestsentsi intensiivsus teisendatakse antigeeni või antikeha kontsentratsiooniks.
• qPCR — teadaoleva proovi seerialahjendustest saadud tsükli läviväärtuste põhjal koostatakse kõver, mille abil hinnatakse tundmatus proovis sisalduva geneetilise materjali hulka.

Kui sirge ei sobi

Mõni meetod ei ole kogu mõõtevahemikus lineaarne. Levinud lahendused on kalibreerimise piiraminee kitsamale lineaarsele piirkonnale, logaritmilise teisenduse rakendamine enne sirge sobitamist, polünoomse ehk kõvera sobituse kasutamine või kaalutud regressiooni kasutamine, kui mõõteviga kontsentratsiooni suurenedes kasvab või kahaneb. See kalkulaator sobitab ainult sirge; kui punktid moodustavad selgelt kõvera, on tulemused vähem usaldusväärsed ja vaja võib minna teistsugust mudelit.

Korduma kippuvad küsimused

Mis on kalibreerimiskõver?

Kalibreerimiskõver on sirge, mis sobitatakse teadaoleva kontsentratsiooniga proovide mõõteriistanäitude kaudu. Seda kasutatakse tundmatu kontsentratsiooniga proovi uue näidu kontsentratsiooniväärtuseks teisendamiseks.

Kui palju andmepunkte kalibreerimiskõver vajab?

Sirge sobitamiseks vajab kalkulaator vähemalt kahte punkti, kuid kahe punkti põhjal ei saa kindlaks teha, kas tegelik seos on sirge. Enamik laboreid kasutab viit kuni kaheksat standardit, mis katavad tundmatute proovide eeldatava vahemiku.

Mida tähendab R² kalibreerimiskõvera korral?

R² mõõdab, kui täpselt andmepunktid sobitatud sirgele vastavad, skaalal 0 kuni 1. Väärtus 1 tähendab, et iga punkt asub täpselt sirgel. Väärtusi üle 0,99 peetakse üldiselt tugeva lineaarse seose tõendiks.

Kas kontsentratsioone saab hinnata standardite vahemikust väljaspool?

Kontsentratsiooni hindamine väikseimast standardist väiksema või suurimast standardist suurema väärtuse korral on ebausaldusväärne, sest puuduvad andmed, mis kinnitaksid sirge püsimist selles piirkonnas. Liiga kõrge näiduga proovi on parem lahjendada või liiga madala näiduga proovi kontsentreerida ning mõõta uuesti kalibreeritud vahemikus.

Miks kuvatakse arvutatud kontsentratsioon mõnikord väärtusena 0?

Kui mõõdetud vastus on sobitatud vabaliikmest väiksem (positiivse kalde korral), annab valem $x = (y - b) / m$ negatiivse arvu. Kalkulaator kuvab sel juhul 0, sest tegelik kontsentratsioon ei saa olla negatiivne. Samuti kuvab see 0, kui kalle on 0; nii juhtub siis, kui kõigil standarditel on sama vastus või sama kontsentratsioon.

Mis vahe on kaldel ja vabaliikmel?

Kalle kirjeldab, kui tundlik on vastus kontsentratsiooni muutuse suhtes. Vabaliige on nullkontsentratsiooni korral prognoositud vastus, mis kajastab sageli taustsignaali, mitte analüüti ennast.