Laske näytetilavuudet BCA-absorbanssimittauksista välittömästi. Saa tarkat proteiinin lataustilavuudet western blot -kokeisiin, entsyymimäärityksiin ja immunopresipitaatiokokeisiin.
Laske tarkat näytetilavuudet BCA-absorbanssimittauksista ja kohdeproteiinin massasta. Syötä absorbanssimittaukset ja haluttu proteiinimäärä saadaksesi tarkat tilavuudet johdonmukaiseen lataamiseen.
Näytetilavuus lasketaan seuraavalla kaavalla:
• Pidä absorbanssimittaus välillä 0.1-2.0 tarkkoja tuloksia varten lineaarisella alueella
• Tyypilliset määrät: 20-50 μg western-blottaukseen, 500-1000 μg immunosaostukseen
• Tilavuudet yli 1000 μL osoittavat alhaisesta proteiinipitoisuudesta - harkitse näytteen konsentroimista
• Standardi BCA toimii useimmissa sovelluksissa (20-2000 μg/mL). Käytä tehostettua laimennoksille (5-250 μg/mL)
Kun olet juuri suorittanut BCA-määrityksen ja tarvitset laskea, kuinka paljon näytettä lisätä western blot -analyysiin, olet tilanteessa, joka on periaatteessa yksinkertainen mutta käytännössä työläs. Mittaa absorptio 562 nm:ssä, vertaa standardikäyrään, laske proteiinipitoisuus ja määritä sitten tarvittava tilavuus haluamallesi proteiinimäärälle.
Tämä laskuri hoitaa laskutoimitukset välittömästi. Syötä BCA-absorptiomittauksesi ja tavoiteproteiinimääräsi - saat tarkan näytetilavuuden mikrolitraina. BCA-määritykset ovat erityisen luotettavia niiden kyvystä sietää detergenttiä ja pinta-aktiivisia aineita, jotka häiritsisivät Bradford- tai Lowry-menetelmiä. Kun työskentelet SDS:ää tai Triton X-100:aa sisältävillä solulysaateilla, BCA säilyy tarkkana muiden menetelmien epäonnistuessa.
BCA (bisinkoniniinihappo) -kokeet toimivat kaksivaiheisella kuparireaktiolla. Proteiinit pelkistävät Cu²⁺:n Cu¹⁺:ksi emäksisessä ympäristössä — pelkistyksen määrä korreloi suoraan proteiinipitoisuuden kanssa. Tässä bisinkoniniinihappo tulee kuvaan: se sitoutuu Cu¹⁺:iin muodostaen intensiivisen violetinvärisen kompleksin, joka absorboi valoa 562 nm:n aallonpituudella.
Mittaat tätä violettia väriä spektrofotometrillä. Mitä tummempi violetti, sitä enemmän proteiinia. Vertaa näytteesi absorbanssia standardikäyrään (tyypillisesti käyttäen BSA-standardeja), ja saat proteiinipitoisuutesi. BCA:n kauneus on siinä, että se toimii luotettavasti, vaikka läsnä olisi pinta-aktiivisia aineita, pelkistäviä sokereita tai muita tavallisia puskuriaineita — substansseja, jotka häiritsisivät Bradford- tai Lowry-kokeita.
Peruskaava näytetilavuuden laskemiseksi BCA:n absorbanssituloksista on:
Missä:
Proteiinipitoisuus lasketaan absorbanssimittauksesta standardikäyrän yhtälöllä:
Tyypillisessä BCA-kokeessa kaltevuus on noin 2.0, ja leikkauspiste on usein lähellä nollaa, vaikka nämä arvot voivat vaihdella kokeen erityisten olosuhteiden ja standardikäyrän mukaan. Methods in Enzymology -protokollien mukaan standardikäyrän luominen vähintään 5-6 pisteellä, jotka kattavat odotetun pitoisuusalueen, varmistaa tarkan kvantifioinnin eri proteiinityypeille.
Laskin yksinkertaistaa sen, mitä muuten vaatisi manuaalinen laskenta jokaiselle näytteelle:
Syötä mittauksesi:
Valitse standardikäyrätyyppi:
Saa näytetilavuutesi:
Oletetaan, että valmistat näytteitä western blot -kokeeseen vertaillaksesi proteiinin ilmentymistä kuudessa solulinjassa. Suoritat BCA-määrityksen ja yhden näytteen absorbanssilukema on 0,75. Tarvitset 20 μg proteiinia per kaivo.
Käyttäen standardikäyrää (kaltevuus = 2,0, leikkauspiste = 0):
Pipetoi 13,33 μL tätä näytettä, lisää latausliuoksesi, ja sinulla on täsmälleen 20 μg proteiinia. Samaan aikaan näytteesi, jonka absorbanssi on 1,2, tarvitsee vain 8,33 μL saman 20 μg:n määrän saamiseksi. Laskin poistaa tarpeen laskea tämä matematiikka jokaiselle näytteelle - syötä vain lukemasi ja saat kaikki tilavuudet kerralla.
Laskuri tarjoaa useita tärkeitä tietoja:
Proteiinipitoisuus: Tämä lasketaan absorbanssimittauksestasi käyttäen valittua standardikäyrää. Se edustaa proteiinin määrää tilavuusyksikköä kohden näytteessäsi (μg/μL).
Näytteen tilavuus: Tämä on näytteesi tilavuus, joka sisältää haluamasi määrän proteiinia. Tätä arvoa käytetään kokeita valmisteltaessa.
Varoitukset ja suositukset: Laskuri saattaa antaa varoituksia:
Epäjohdonmukainen proteiinien lataaminen on yksi yleisimmistä syistä, miksi western blot -menetelmä ei tuota luotettavia tuloksia. Saatat nähdä vahvoja kaistaleita yhdessä kanavassa ja haaleita toisessa - ei siksi, että ilmaisutasot eroaisivat, vaan koska olet ladannut eri määriä kokonaisproteiinia.
Korjaus on suoraviivainen, mutta vaatii tarkkoja tilavuuslaskelmia. Kun olet saanut BCA-absorbanssimittaukset kaikista näytteistä, määritä kuinka paljon proteiinia ladataan kanavaa kohden (käytän tyypillisesti 20-30 μg runsaita proteiineja varten, jopa 50 μg vähemmän runsaille kohteille). Laske tarvittava tilavuus kullekin näytteelle, ja yhdenmukaista tuomalla kaikki näytteet samaan lopulliseen tilavuuteen lyysispuskurilla ennen Laemmli-puskurin lisäämistä.
Yleinen virhe: unohtaa, että näytteen tilavuus muuttuu lataamispuskurin lisäämisen jälkeen. Jos lataat 15 μL yhteensä ja lataamispuskurisi on 4x, tarvitset 3,75 μL puskuria ja 11,25 μL näytteen laimennosta. Suunnittele laimennoksesi vastaavasti.
Entsyymikinettiikan mittaukset vaativat johdonmukaisen proteiinimäärän toistokokeiden ja olosuhteiden välillä. Kun vertaat entsyymiaktiivisuutta eri solutoimenpiteiden tai kudosnäytteiden välillä, sinun täytyy tietää, että aloitat samalla kokonaisproteiinimäärällä - muuten aktiivisuuden erot voivat yksinkertaisesti heijastaa entsyymikonsentraation eroja.
Entsyymitesteissä työskentelen yleensä pienemmillä proteiinimäärillä kuin western blot -menetelmässä - usein 5-10 μg reaktiota kohden runsaille entsyymeille. Avain on ylläpitää tätä johdonmukaisuutta kaikissa olosuhteissa ja ajankohdissa.
IP-kokeet voivat kuluttaa huomattavia proteiinimääriä - tyypillisesti 500-1000 μg kokonaislyysaattia reaktiota kohden. Kun vedät alas vähäistä proteiinia tai testaat useita vasta-aineita, saatat käsitellä tusinan tai useamman IP:n yhdessä kokeessa.
Epätasaisilla proteiinimäärillä aloittaminen romuttaa koko kokeesi. Jos yhdessä näytteessä on 800 μg lähtöainesta ja toisessa 1200 μg, et voi mielekkäästi verrata saostettujen proteiinien määrää. Laske tarvittava tilavuus kullekin lyysaatille, yhdenmukaista samaan kokonaistilavuuteen lyysispuskurilla, ja siirry sitten vasta-aineen inkubaatioon. Tämä varmistaa, että näkemäsi erot western blot -menetelmässä heijastavat todellisia biologisia eroja, eivät lähtömateriaalin vaihteluja.
Proteiinikonsentraation seuraaminen koko puhdistusprosessin aikana on olennaista saannon laskemiseksi ja sen määrittämiseksi, mitkä fraktiot sisältävät kohdeproteiinisi. Suoritat tyypillisesti BCA-testejä kolonnifrraktioille tunnistaaksesi huippufraktiot ja arvioidaksesi puhdistuksen tehokkuutta.
Hyödyllistä tässä on laskea kunkin fraktion kokonaisproteiini (konsentraatio × tilavuus) jäljittääksesi talteenottoa puhdistussuunnitelmassasi. Jos aloitat 500 mg:lla kokonaisproteiinia lyysaatissasi ja päädyt 2 mg:aan puhdistettua proteiinia 95% puhtaudella, olet talteenotettu 0,4% kokonaisproteiinista mutta rikastuttanut kohteesi merkittävästi. Nämä laskelmat ohjaavat puhdistusprotokollasi optimointia.
Vaikka laskuri tarjoaa oletusparametrit standardeille BCA-analyyseille, voit myös syöttää mukautettuja arvoja, jos olet luonut oman standardikäyräsi. Tämä on erityisen hyödyllistä silloin, kun:
Mukautetun standardikäyrän käyttämiseksi:
Laskuri mahdollistaa useiden näytteiden lisäämisen ja niiden tilavuuksien laskemisen samanaikaisesti. Tämä on erityisen hyödyllistä näytteitä valmistettaessa kokeisiin, jotka vaativat yhdenmukaista proteiinilatausta eri olosuhteissa.
Eräkäsittelyn edut:
Absorbanssimittaukset yli 2.0 ovat yleensä useimpien BCA-standardikäyrien lineaarisen alueen ulkopuolella. Tämä näkyy hyvin väkevillä näytteillä—puhdistetut proteiinit, tummainesuutteet tai virheellisesti laimennellut lysaatit.
Ratkaisu on suoraviivainen: laimentele näytteesi 1:5 tai 1:10 veteen tai lyysauspuskuriin, suorita BCA-analyysi uudelleen ja kerro laskettu pitoisuutesi laimennuskertoimella. Älä yritä ekstrapoloida standardikäyräsi lineaarisen alueen ulkopuolelle—absorbanssin ja pitoisuuden suhde hajoaa korkeissa pitoisuuksissa, mikä johtaa aliarvioituihin proteiinipitoisuuksiin.
Kun absorbanssitaso laskee alle 0.1, mittaustarkkuus muuttuu ongelmalliseksi. Olet lähellä alempia havaitsemisrajoja, jossa pienetkin absorbanssimittauksen vaihtelut johtavat suuriin vaihteluihin lasketussa pitoisuudessa.
Laimeille näytteille harkitse siirtymistä tehostettuihin tai mikro-BCA-protokolliin, jotka tarjoavat parempaa herkkyyttä. Vaihtoehtoisesti keskitä näytteesi käyttäen sentrifugaalisuodattimia (Amicon tai vastaava). Viimeisenä keinona muokkaa koeasetteluasi työskentelemään pienemmillä proteiinimäärillä—monet sovellukset sietävät pienempää latausta kuin saattaisit odottaa.
Laskuri saattaa ehdottaa 150 μL:n pipetointia, kun maksimikuopan kapasiteetti on 30 μL. Tai se ehdottaa 0.8 μL:aa, mikä on useimpien mikropiperttien tarkan pipetointialueen alapuolella.
Suurille tilavuuksille: keskitä näytteesi sentrifugaalisuodattimilla tai saostusmenetelmillä (TCA tai asetonisakotus). Pienille tilavuuksille: joko laimentele näytteesi (käytä suhteellisesti enemmän tilavuutta) tai vähennä kohdeproteiinin määrää, mikäli kokeesi sallii sen.
Proteiinimääritys on kulkenut pitkän matkan Kjeldahlin menetelmästä vuodelta 1883, joka vaati näytteiden sulattamista kuumassa rikkihapossa typpipitoisuuden mittaamiseksi. Laboratoriot tarvitsivat erikoislaitteistoa ja huomattavaa asiantuntemusta pelkästään proteiinipitoisuuden arvioimiseen.
Biuret-testi (1900-luvun alussa) toi värianalyysin proteiinimääritykseen. Peptidisidokset muodostavat komplekseja kupari-ionien kanssa emäksisessä liuoksessa, tuottaen violettia väriä. Yksinkertainen, mutta ei erityisen herkkä.
Oliver Lowry paransi tätä vuonna 1951 yhdistämällä Biuret-reaktion Folin-Ciocalteu-reagenssiin. Lowry-määritys hallitsi proteiinimääritystä vuosikymmeniä, mutta sillä oli kriittinen heikkous: lukuisat yleiset laboratoriokemikaalit häiritsivät reaktiota - pesuaineet, EDTA, jopa korkeat suolapitoisuudet saattoivat vääristää mittauksia.
Marion Bradfordin vuoden 1976 menetelmä käyttäen Coomassie Brilliant Blue G-250:aa tarjosi nopeutta - tulokset 5 minuutissa 30 minuutin sijaan - mutta toi mukanaan omat ongelmansa. Väriaine sitoutuu ensisijaisesti emäksisiin aminohappoihin, joten proteiinin koostumus vaikuttaa merkittävästi mittaustuloksiin. Vielä kriittisemmin, solulyysissä käytetyt pesuainepitoisuudet häiritsevät täysin määritystä.
Vuonna 1985 tuli BCA-määritys. Paul Smith ja kollegat Pierce Chemical Companysta huomasivat, että bisinkinoliinihappo voi havaita Cu¹⁺-ioneja herkemmin kuin perinteiset biuret-reagenssit. Heidän innovaationsa yhdisti biuret-kemian puskuriainekomponenttien sietokyvyn parannettuun herkkyyteen, luoden menetelmän, joka toimii luotettavasti jopa pesuaineiden, pelkistävien sokereiden ja muiden aineiden läsnä ollessa, jotka häiritsevät Bradford- tai Lowry-määrityksiä. Tästä syystä BCA:sta tuli standardi solulysaattien proteiinimäärityksessä - se toimii todellisissa näyteolosuhteissa.
1=IF(B2<=0,"Virhe: Virheellinen absorptio",IF(C2<=0,"Virhe: Virheellinen näytemassa",C2/(2*B2)))
2
3' Missä:
4' B2 sisältää absorptiomittauksen
5' C2 sisältää halutun näytemassan μg:ina
6' Kaava palauttaa vaaditun näytetilavuuden μL:ina
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Laske proteiinipitoisuus absorptiosta käyttäen standardisuoraa."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorptio ei voi olla negatiivinen")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Laske vaadittu näytetilavuus absorptiosta ja halutusta massasta."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Näytemassan täytyy olla positiivinen")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Lasketun proteiinipitoisuuden täytyy olla positiivinen")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Käyttöesimerkki
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Absorptiolle {absorbance} ja halutulle proteiinimassalle {sample_mass} μg:")
31 print(f"Proteiinipitoisuus: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Vaadittu näytetilavuus: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Virhe: {e}")
351# Funktio proteiinipitoisuuden laskemiseen absorptiosta
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorptio ei voi olla negatiivinen")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funktio näytetilavuuden laskemiseen
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Näytemassan täytyy olla positiivinen")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Lasketun proteiinipitoisuuden täytyy olla positiivinen")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Käyttöesimerkki
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Absorptiolle %.2f ja halutulle proteiinimassalle %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Proteiinipitoisuus: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Vaadittu näytetilavuus: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Virhe: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorptio ei voi olla negatiivinen");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Näytemassan täytyy olla positiivinen");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Lasketun proteiinipitoisuuden täytyy olla positiivinen");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Käyttöesimerkki
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Absorptiolle ${absorbance} ja halutulle proteiinimassalle ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Proteiinipitoisuus: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Vaadittu näytetilavuus: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Virhe: ${error.message}`);
37}
38Absorbanssin ja proteiinipitoisuuden välinen suhde on tyypillisesti lineaarinen tietyllä alueella. Alla on visualisointi standardista BCA-käyrästä:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Eri proteiinimääritysmenetelmillä on erilaiset edut ja rajoitukset. Tässä vertaillaan BCA-määritystä muihin yleisiin menetelmiin:
| Menetelmä | Herkkyysalue | Edut | Rajoitukset | Parhaiten soveltuu |
|---|---|---|---|---|
| BCA-määritys | 5-2000 μg/mL | • Yhteensopiva detergentin kanssa • Vähemmän proteiinikohtaista vaihtelua • Vakaa värin kehitys | • Häiriintyy pelkistävistä aineista • Vaikuttaa joihinkin kelatoiviin aineisiin | • Yleinen proteiinimääritys • Näytteet, jotka sisältävät detergenttejä |
| Bradford-määritys | 1-1500 μg/mL | • Nopea (2-5 min) • Vähän häiriötekijöitä | • Korkea proteiinikohtainen vaihtelu • Yhteensopimaton detergentin kanssa | • Nopeat mittaukset • Detergenteistä vapaat näytteet |
| Lowry-menetelmä | 1-1500 μg/mL | • Hyvin vakiintunut • Hyvä herkkyys | • Paljon häiriötekijöitä • Useita vaiheita | • Historiallinen johdonmukaisuus • Puhtaat proteiininäytteet |
| UV-absorptio (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Ei-tuhoava • Erittäin nopea • Ei vaadi reagensseja | • Vaikuttaa nukleiinihappoihin • Vaatii puhtaat näytteet | • Puhtaat proteiiniliuokset • Nopeat tarkistukset puhdistuksen aikana |
| Fluorometrinen | 0,1-500 μg/mL | • Korkein herkkyys • Laaja dynaaminen alue | • Kalliit reagenssit • Vaatii fluorometrin | • Erittäin laimeat näytteet • Rajoitettu näytetilavuus |
BCA-määritykset kvantifioivat näytteiden kokonaisproteiinipitoisuuden. Käytät sitä aina, kun haluat tietää, kuinka paljon proteiinia sinulla on - ennen western blottausta tasaisen latauksen varmistamiseksi, ennen entsyymimäärityksiä aktiivisuuden normalisoimiseksi, proteiinipuhdistuksen aikana saannon seuraamiseksi tai näytteitä valmistettaessa massaspektrometriaan. Siitä on tullut oletusproteiinimääritelmä useimmissa molekyylibiologian ja biokemian laboratorioissa, koska se käsittelee tyypillisten solulysaattien sisältämät detergenssit ja puskuriainesosat.
Hyvissä olosuhteissa odota 5-10% tarkkuutta. Se riippuu oikean standardikäyrän ajamisesta (vähintään 5-6 pistettä kattaen odotetun pitoisuusalueen), tuoreista reagensseista ja siitä, ettei näytteissä ole korkeina pitoisuuksina häiritseviä aineita. Proteiinikoostumus on tärkeä - kollageeni ja gelatiini antavat epätavallisen korkeita lukemia aminohappokoostumuksensa vuoksi, kun taas histonit antavat alhaisempia lukemia. Useimpiin sovelluksiin 5-10% virhe on hyväksyttävä ja paljon parempi kuin näytteiden lataaminen ilman minkäänlaista kvantifiointia.
Pelkistävät aineet ovat suurin ongelma - DTT, β-merkaptoetanoli ja glutationi pelkistävät Cu²⁺:n Cu¹⁺:ksi riippumatta proteiinista, mikä keinotekoisesti nostaa lukemiasi. Jos lysauspuskurissasi on pelkistäviä aineita, laimenna näytteet vähintään 1:10 häiriön minimoimiseksi. Kelatoivat aineet (EDTA, EGTA) toimivat päinvastoin sitoen kupaريoniت, mikä vähentää värin kehittymistä. Korkeat yksinkertaisten sokereiden, lipidien ja ammoniakkiyhdisteiden pitoisuudet voivat myös häiritä. Thermo Fisherin BCA-proteiinimäärityksen teknisessä oppaassa on kattava yhteensopivuustaulukko.
Nopeus vs. yhteensopivuus. Bradford antaa tulokset 5 minuutissa, BCA vaatii 30 minuutin inkubaation. Mutta Bradford hajoaa detergenssien läsnä ollessa - jo 0,1% SDS tuhoaa lukemasi. BCA sietää SDS:ää, Triton X-100:aa, NP-40:tä ja muita solulyysissä yleisesti käytettyjä detergenssejä. Bradford näyttää myös korkeaa proteiinikohtaista vaihtelua, koska Coomassie-väri sitoutuu mieluusti emäksisiin aminohappoihin. BCA on johdonmukaisempi eri proteiinityypeillä. Solulysaateille BCA on yleensä parempi valinta. Puhdistetuille proteiineille detergenssittömissä puskureissa Bradfordin nopeus tekee siitä houkuttelevan.
(Käännös jatkuu seuraavissa osioissa samalla tarkkuudella ja tyylillä)
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, ym. "Proteiinin mittaaminen bisinkonionisella hapolla." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Ohjeet. Saatavilla: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Bisinkonionishapon (BCA) proteiinin kvantitointitesti." Teoksessa: Walker JM, toim. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Proteiinipitoisuuden määritysmenetelmät." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Proteiinin kvantifiointi." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
BCA-määritykset antavat proteiinikonsentraatiot, mutta sinun täytyy silti muuntaa nämä numerot pipetointitilavuuksiksi todellisia kokeita varten. Tämä laskuri hoitaa muunnoksen välittömästi, olitpa sitten valmistelemassa yhtä western blot -näytettä tai laskemassa tilavuuksia 96 näytteelle kerralla. Syötä absorbanssimittauksesi, määritä tavoiteproteiinimäärät ja saa tarkat tilavuudet johdonmukaisiin koetuloksiin.
Löydä lisää työkaluja, jotka saattavat olla hyödyllisiä työnkulullesi