Laske tarkat näytteen tilavuudet BCA-testin absorptiolukemien ja halutun proteiinimassan perusteella. Olennaista johdonmukaiselle proteiinilastille western blot -menetelmissä ja muissa laboratoriokäytännöissä.
Tämä työkalu laskee tarvittavan näytteen tilavuuden BCA-absorptiotaulukoiden ja näytteen massan perusteella. Syötä kunkin näytteen absorptioväriarvo ja näytteen massa lasketaksesi vastaava näytteen tilavuus.
Näytteen tilavuus lasketaan seuraavalla kaavalla:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbanssinäytevolyymilaskuri on erityinen työkalu, joka on suunniteltu auttamaan tutkijoita ja laboratorioteknikkoja määrittämään tarkasti sopiva näytevolyymi kokeita varten BCA (bicinchoninic acid) -testitulosten perusteella. Tämä laskuri ottaa BCA-testin absorbanssilukemat ja halutun näytemassan huomioon laskettaessa tarkkaa volyymiä, joka tarvitaan johdonmukaiseen proteiinin kuormitukseen sovelluksissa, kuten western blotting, entsymaattiset testit ja muut proteiinianalyysitekniikat.
BCA-testi on yksi laajimmin käytetyistä menetelmistä proteiinien kvantifioimiseksi biokemian ja molekyylibiologian laboratorioissa. Mittaamalla proteiininäytteidesi absorbanssia ja vertaamalla niitä standardikäyrään voit määrittää proteiinipitoisuuden suurella tarkkuudella. Laskurimme yksinkertaistaa tätä prosessia muuntamalla automaattisesti absorbanssilukemat tarkiksi näytevolyymeiksi, joita tarvitaan kokeissasi.
Bicinchoninic Acid (BCA) -testi on biokemiallinen testi, jolla määritetään proteiinin kokonaispitoisuus liuoksessa. Tämän testin periaate perustuu Cu²⁺-proteiiniyhdistelmän muodostumiseen emäksisissä olosuhteissa, jota seuraa Cu²⁺-ionien pelkistyminen Cu¹⁺-ioneiksi. Pelkistyminen on suhteessa läsnä olevaan proteiiniin. BCA muodostaa purppuranvärisen kompleksin Cu¹⁺-ionien kanssa emäksisissä ympäristöissä, mikä tarjoaa perustan proteiinien pelkistymisen seurannan.
Purppuranvärisen kompleksin intensiivisyys kasvaa suhteessa proteiinipitoisuuteen, jota voidaan mitata spektrofotometrillä noin 562 nm:n aallonpituudella. Absorbanssilukemat verrataan sitten standardikäyrään, jotta voidaan määrittää tuntemattomien näytteiden proteiinipitoisuus.
Peruskaava näytevolyymin laskemiseksi BCA-absorbanssituloksista on:
Missä:
Proteiinipitoisuus lasketaan absorbanssilukemasta standardikäyrän kaavan avulla:
Tyypillisessä BCA-testissä kaltevuus on yleensä noin 2.0, ja leikkaus on usein lähellä nollaa, vaikka nämä arvot voivat vaihdella erityisten testausolosuhteiden ja standardikäyrän mukaan.
Laskurimme yksinkertaistaa prosessia, jolla määritetään näytevolyymit BCA-testituloksista. Seuraa näitä vaiheita saadaksesi tarkkoja laskelmia:
Syötä näytetiedot:
Valitse standardikäyrän tyyppi:
Näe tulokset:
Kopioi tai vie tulokset:
Käydään läpi käytännön esimerkki:
Tämä tarkoittaa, että sinun tulisi kuormittaa 13.33 μL näytettä saadaksesi 20 μg proteiinia.
Laskuri tarjoaa useita tärkeitä tietoja:
Proteiinipitoisuus: Tämä lasketaan absorbanssilukemastasi valitun standardikäyrän avulla. Se edustaa proteiinin määrää per yksikkötilavuus näytteessäsi (μg/μL).
Näytevolyymi: Tämä on sen näytteen määrä, joka sisältää halutun proteiinimäärän. Tämä arvo on se, mitä käytät valmistellessasi kokeitasi.
Varoitukset ja suositukset: Laskuri voi antaa varoituksia:
Yksi yleisimmistä sovelluksista tälle laskurille on näytteiden valmistelu western blottingia varten. Johdonmukainen proteiinin kuormitus on ratkaisevan tärkeää luotettavien western blot -tulosten saamiseksi, ja tämä laskuri varmistaa, että kuormitat saman määrän proteiinia jokaiselle näytteelle, vaikka niiden pitoisuudet vaihtelevat.
Esimerkkityönkulku:
Entsymaattisissa testeissä on usein tarpeen käyttää tiettyä määrää proteiinia standardoimaan reaktiot olosuhteet eri näytteiden tai kokeiden välillä.
Esimerkkityönkulku:
Immunoprecipitaatiokokeissa on tärkeää aloittaa johdonmukaisella proteiinimäärällä, jotta voit verrata tuloksia eri olosuhteiden välillä.
Esimerkkityönkulku:
Proteiinipuhdistuksen aikana on usein tarpeen seurata proteiinipitoisuutta ja laskea saantoja eri vaiheissa.
Esimerkkityönkulku:
Vaikka laskuri tarjoaa oletusparametreja standardi BCA-testeille, voit myös syöttää mukautettuja arvoja, jos olet luonut oman standardikäyräsi. Tämä on erityisen hyödyllistä, kun:
Käyttääksesi mukautettua standardikäyrää:
Laskuri mahdollistaa useiden näytteiden lisäämisen ja niiden volyymien laskemisen samanaikaisesti. Tämä on erityisen hyödyllistä, kun valmistellaan näytteitä kokeita varten, jotka vaativat johdonmukaista proteiinikuormitusta eri olosuhteissa.
Useiden näytteiden käsittelyn hyödyt:
Jos absorbanssilukemasi on yli 2.0, se voi olla BCA-testin lineaarisen alueen ulkopuolella. Tällaisissa tapauksissa:
Absorbanssilukemille, jotka ovat alle 0.1, saatat olla havaitsemisrajan lähellä, mikä voi vaikuttaa tarkkuuteen. Harkitse:
Jos laskuri ehdottaa volyymiä, joka on liian suuri sovelluksellesi:
Proteiinien tarkka kvantifiointi on ollut perustarve biokemiassa ja molekyylibiologiassa siitä lähtien, kun nämä alat syntyivät. Varhaiset menetelmät perustuivat typpipitoisuuden määrittämiseen, mikä oli aikaa vievää ja vaati erikoislaitteita.
Kjeldahl-menetelmä (1883): Yksi varhaisimmista menetelmistä proteiinikvantifioinnille, joka perustuu typpipitoisuuden mittaamiseen.
Biuret-testi (1900-luvun alku): Tämä menetelmä perustuu peptidisiteiden reaktioon kupari-ionien kanssa emäksisessä liuoksessa, mikä tuottaa violetin värin.
Lowry-testi (1951): Oliver Lowryn kehittämä menetelmä yhdisti biuret-reaktion Folin-Ciocalteu-reagenssiin, mikä lisäsi herkkyyttä.
Bradford-testi (1976): Marion Bradford kehitti tämän menetelmän käyttäen Coomassie Brilliant Blue G-250 -väria, joka sitoutuu proteiineihin ja siirtää absorptiomaksimin.
BCA-testi (1985): Paul Smith ja kollegat Pierce Chemical Companyltä kehittivät tämän menetelmän yhdistämällä biuret-reaktion BCA-havaitsemiseen, tarjoten parannettua herkkyyttä ja yhteensopivuutta pesuaineiden kanssa.
BCA-testi kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1985 Smithin ja muiden kirjoittamassa artikkelissa "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Se kehitettiin vastaamaan olemassa olevien menetelmien rajoituksia, erityisesti kemikaalien häiriöitä, joita käytetään yleisesti proteiinien eristämisessä ja puhdistuksessa.
Keskeinen innovaatio oli käyttää bicinchoninic acidia havaitsemaan Cu¹⁺-ioneja, jotka syntyvät proteiinien välittämästä Cu²⁺-pelkistyksestä, muodostaen purppuranvärisen kompleksin, jota voidaan mitata spektrofotometrisesti. Tämä tarjosi useita etuja:
Sen käyttöönoton jälkeen BCA-testi on tullut yhdeksi laajimmin käytetyistä proteiinikvantifiointimenetelmistä biokemian ja molekyylibiologian laboratorioissa ympäri maailmaa.
1=IF(B2<=0,"Virhe: Virheellinen absorbanssi",IF(C2<=0,"Virhe: Virheellinen näytemassa",C2/(2*B2)))
2
3' Missä:
4' B2 sisältää absorbanssilukeman
5' C2 sisältää halutun näytemassan μg:na
6' Kaava palauttaa vaaditun näytevolyymin μL:na
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Laske proteiinipitoisuus absorbanssista standardikäyrän avulla."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbanssi ei voi olla negatiivinen")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Laske tarvittava näytevolyymi absorbanssin ja halutun massan perusteella."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Näytemassan on oltava positiivinen")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Lasketun proteiinipitoisuuden on oltava positiivinen")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Esimerkkikäyttö
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Absorbanssille {absorbance} ja halutulle proteiinimassalle {sample_mass} μg:")
31 print(f"Proteiinipitoisuus: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Vaadittu näytevolyymi: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Virhe: {e}")
351# Funktio proteiinipitoisuuden laskemiseksi absorbanssista
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbanssi ei voi olla negatiivinen")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funktio näytevolyymin laskemiseksi
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Näytemassan on oltava positiivinen")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Lasketun proteiinipitoisuuden on oltava positiivinen")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Esimerkkikäyttö
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Absorbanssille %.2f ja halutulle proteiinimassalle %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Proteiinipitoisuus: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Vaadittu näytevolyymi: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Virhe: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbanssi ei voi olla negatiivinen");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Näytemassan on oltava positiivinen");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Lasketun proteiinipitoisuuden on oltava positiivinen");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Esimerkkikäyttö
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Absorbanssille ${absorbance} ja halutulle proteiinimassalle ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Proteiinipitoisuus: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Vaadittu näytevolyymi: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Virhe: ${error.message}`);
37}
38Suhde absorbanssin ja proteiinipitoisuuden välillä on tyypillisesti lineaarinen tietyllä alueella. Alla on visualisointi BCA-standardikäyrästä:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Eri proteiinikvantifiointimenetelmillä on erilaisia etuja ja rajoituksia. Tässä on, kuinka BCA-testi vertautuu muihin yleisiin menetelmiin:
| Menetelmä | Herkkyysalue | Edut | Rajoitukset | Parasta varten |
|---|---|---|---|---|
| BCA-testi | 5-2000 μg/mL | • Yhteensopiva pesuaineiden kanssa • Vähemmän proteiini-proteiini-varianssia • Vakaat väri kehitys | • Häiriintyy pelkistysaineista • Vaikuttavat jotkin chelatoivat aineet | • Yleinen proteiinikvantifiointi • Näytteet, jotka sisältävät pesuaineita |
| Bradford-testi | 1-1500 μg/mL | • Nopea (2-5 min) • Vain vähän häiriöitä | • Suuri proteiini-proteiini-varianssi • Yhteensopimaton pesuaineiden kanssa | • Nopeita mittauksia • Pesuaineettomat näytteet |
| Lowry-menetelmä | 1-1500 μg/mL | • Hyvin vakiintunut • Hyvä herkkyys | • Monet häiriötekijät • Useita vaiheita | • Historiallinen johdonmukaisuus • Puhtaat proteiininäytteet |
| UV-absorptio (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Tuhoamaton • Erittäin nopea • Ei reagensseja tarvita | • Vaikuttavat nukleiinihapot • Vaatii puhtaita näytteitä | • Puhtaat proteiiniliuokset • Nopeat tarkistukset puhdistuksen aikana |
| Fluorometrinen | 0.1-500 μg/mL | • Korkein herkkyys • Laaja dynaaminen alue | • Kalliit reagenssit • Vaatii fluorometrin | • Erittäin laimeat näytteet • Rajoitettu näytemäärä |
BCA (bicinchoninic acid) -testiä käytetään ensisijaisesti proteiinipitoisuuden kvantifioimiseen näytteessä. Sitä käytetään laajalti biokemiassa, solubiologiassa ja molekyylibiologiassa sovelluksissa, kuten western blotting, entsymaattiset testit, immunoprecipitaatio ja proteiinipuhdistus.
BCA-testi on yleensä tarkka 5-10 %:n sisällä, kun se suoritetaan oikein. Sen tarkkuus riippuu useista tekijöistä, mukaan lukien standardikäyrän laatu, häiriöiden puuttuminen ja onko tuntemattoman proteiinin koostumus samanlainen kuin käytetyn standardiproteiinin.
Useat aineet voivat häiritä BCA-testin tuloksia, mukaan lukien:
Pääasialliset erot ovat:
Jos laskurisi näyttää erittäin suurta näytevolyymiä, se yleensä tarkoittaa matalaa proteiinipitoisuutta alkuperäisessä näytteessäsi. Tämä voi johtua:
Harkitse näytteen tiivistämistä tai halutun proteiinimäärän säätämistä alaspäin, jos kokeesi sallii sen.
Tämä laskuri on erityisesti suunniteltu BCA-testin tuloksille. Vaikka perusperiaate (pitoisuuden muuntaminen volyymiksi) pätee muihin menetelmiin, absorbanssin ja proteiinipitoisuuden välinen suhde vaihtelee eri testeissä. Toisten menetelmien, kuten Bradfordin tai Lowryn, osalta sinun on käytettävä erilaisia standardikäyrän parametreja.
Jos absorbanssilukemasi on lineaarisen alueen ulkopuolella (yleensä >2.0):
Bovine Serum Albumin (BSA) on yleisimmin käytetty standardi BCA-testeissä, koska se on:
Kuitenkin, jos näytteesi sisältävät vallitsevan proteiinin, joka poikkeaa merkittävästi BSA:sta, harkitse sen proteiinin käyttöä standardina tarkempien tulosten saamiseksi.
Purppuranvärinen väri, joka kehittyy BCA-reaktiossa, on vakaa useita tunteja huoneenlämmössä ja sitä voidaan mitata milloin tahansa tuona aikana. Kuitenkin parhaan tuloksen saamiseksi suositellaan mittaamaan kaikki standardit ja näytteet suunnilleen samaan aikaan värin kehittämisen jälkeen.
Vaikka on teknisesti mahdollista käyttää aiemmin tehtyä standardikäyrää, sitä ei suositella tarkkojen kvantifiointitulosten saamiseksi. Reagenssien, inkubointiolosuhteiden ja instrumentin kalibroinnin vaihtelut voivat vaikuttaa absorbanssin ja proteiinipitoisuuden väliseen suhteeseen. Luotettavien tulosten saamiseksi luo uusi standardikäyrä jokaiselle testille.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Ohjeet. Saatavilla: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nyt kun ymmärrät BCA-proteiinikvantifioinnin ja näytevolyymin laskemisen periaatteet, kokeile laskuriamme yksinkertaistaaksesi laboratorio työprosessejasi. Syötä vain absorbanssilukemat ja haluttu näytemassa saadaksesi välittömiä, tarkkoja näytevolymlaskelmia.
Olitpa valmistamassa näytteitä western blottingia, entsymaattisia testejä tai muita proteiinipohjaisia kokeita varten, laskurimme auttaa varmistamaan johdonmukaiset ja luotettavat tulokset. Säästä aikaa, vähennä virheitä ja paranna kokeidesi toistettavuutta BCA Absorbanssinäytevolyymilaskurilla.
Löydä lisää työkaluja, jotka saattavat olla hyödyllisiä työnkulullesi