מחשבון דילול תאים - כלי דילול מעבדתי מדויק

מחשבון לדילול תאים

מחשבון לדילול תאים קובע כמה תרחיף תאים וכמה חומר מדלל יש לערבב כדי להגיע לריכוז תאים יעד בנפח סופי שנבחר. משתמשים בו בתרביות תאים, במיקרוביולוגיה ובעבודות מעבדה אחרות שבהן יש להביא דגימה לריכוז מדויק לפני השימוש.

מה משמעותו של דילול תאים

דילול תרחיף תאים אינו משנה את מספר התאים שהוא מכיל. הוא משנה רק את הנפח שבו התאים נמצאים, וכך מוריד את הריכוז. תרחיף שנספר בריכוז של 1,000,000 תאים למיליליטר (תאים/מ"ל) עדיין מכיל את אותו מספר כולל של תאים לאחר הדילול. המספר הזה פשוט מתפזר על פני כמות גדולה יותר של נוזל.

במעבדות מדללים תאים לפני שלבים שגרתיים רבים: פיצול תרבית גדלה לפלסקונים חדשים, זריעת מספר קבוע של תאים בכל בארית של צלחת, הקפאת תאים לאחסון, או הכנת דגימה למונה תאים או לציטומטר זרימה.

נוסחת דילול תאים

החישוב מבוסס על כלל אחד. מספר התאים שנלקחו מתרחיף המקור, כשהוא מוכפל בריכוז שלהם, חייב להיות שווה למספר התאים בנפח הסופי, כשהוא מוכפל בריכוז היעד:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — ריכוז התחלתי (ריכוז המקור), בתאים למ"ל
• V₁ — נפח תרחיף המקור שיש להשתמש בו, במ"ל
• C₂ — ריכוז היעד, בתאים למ"ל
• V₂ — הנפח הסופי הכולל הנדרש, במ"ל

פתרון המשוואה עבור V₁ נותן את נפח תרחיף המקור שיש לשאוב בפיפטה:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

שאר הנפח הסופי הוא חומר מדלל, בדרך כלל מדיום לתרבית תאים, תמיסת מלח מאוזנת בפוספט (PBS) או בופר אחר:

נפח החומר המדלל = V₂ − V₁

ריכוז היעד (C₂) אינו יכול להיות גבוה יותר מריכוז המקור (C₁). דילול רק מוריד את הריכוז. כדי להעלות אותו יש לסרכז את התאים ולהשעות אותם מחדש בנפח נוזל קטן יותר.

כיצד לחשב דילול תאים

1. סופרים את תרחיף המקור באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי כדי לקבל את C₁.
2. מציינים את ריכוז היעד, C₂, הנדרש בפרוטוקול.
3. קובעים את הנפח הסופי הכולל, V₂, הנדרש.
4. מחשבים V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. מחשבים את נפח החומר המדלל לפי V₂ − V₁.
6. שואבים בפיפטה V₁ מתרחיף המקור אל תוך מבחנה, ואז מוסיפים את נפח החומר המדלל של המצע או הבופר.

דוגמה פתורה

תרחיף מקור נספר בריכוז של 1,000,000 תאים למ"ל. פרוטוקול דורש 100,000 תאים למ"ל בנפח סופי של 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100,000 × 10) ÷ 1,000,000 = 1,000,000 ÷ 1,000,000 = 1 mL

נפח החומר המדלל = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

נטילת 1 mL מתרחיף המקור והוספת 9 mL מצע נותנות 10 mL של תרחיף בריכוז 100,000 תאים למ"ל.

דוגמה שנייה

בדיקה בצלחת בעלת 96 באריות דורשת 10,000 תאים בכל בארית בתוך 200 מיקרוליטרים (μL) של מצע בכל בארית. זהו ריכוז יעד של 50,000 תאים למ"ל, מכיוון ש-10,000 תאים חלקי 0.2 mL שווים ל-50,000 תאים למ"ל. ריכוז המקור הוא 2,000,000 תאים למ"ל, ונדרש נפח כולל של 20 mL כדי לכסות את הצלחת, בתוספת מסוימת שתפצה על אובדן בעת פיפטציה.

V₁ = (50,000 × 20) ÷ 2,000,000 = 1,000,000 ÷ 2,000,000 = 0.5 mL

נפח החומר המדלל = 20 − 0.5 = 19.5 mL

ערבוב 0.5 mL מתרחיף המקור עם 19.5 mL מצע נותן 20 mL בריכוז 50,000 תאים למ"ל, כלומר דילול של 1 ל-40.

מקורות לשגיאות

הנוסחה עצמה מדויקת. השגיאות נובעות מהמספרים שמציבים בה.

• שגיאת ספירה. ספירת תאים שגויה מובילה ישירות לדילול שגוי. ספירת כל ארבעת הריבועים שבפינות של רשת המוציטומטר וחישוב הממוצע מפחיתים את הסיכון הזה.
• תאים מצטברים. צבר תאים נראה כתא יחיד במיקרוסקופ, אך למעשה הוא מורכב מכמה תאים, ולכן הוא מוריד את הריכוז הנמדד.
• טווח הפיפטה. פיפטה שמשתמשים בה מחוץ לטווח הנפח המדורג שלה נותנת תוצאות לא מדויקות. פיפטה של 1000 μL שמכוונת לניפוק של 5 μL אינה אמינה; יש להשתמש בפיפטה קטנה יותר.
• בלבול ביחידות. ערבוב בין תאים למ"ל לתאים למיקרוליטר יוצר שגיאה גדולה פי אלף מדי או קטנה פי אלף מדי.
• תאים מתים. ספירת תאים גולמית כוללת תאים מתים, אלא אם נעשה שימוש בצביעת חיוניות, כגון כחול טריפאן. הדבר עלול להפריז במספר התאים החיים שנמצאים בפועל.

מגבלות המחשבון

המחשבון דוחה מספרים שאי אפשר לתת באמצעותם תשובה שימושית:

• כל ערך חייב להיות גדול מאפס.
• ריכוז היעד אינו יכול להיות גבוה יותר מריכוז המקור.
• ריכוז המקור חייב להיות לכל היותר 1 טריליון תאים למ"ל (1 × 10¹²).
• נפח המקור שהמחשבון מחשב חייב להיות לפחות 0.001 mL, שהם 1 מיקרוליטר. אי אפשר לשאוב במדויק נפח קטן יותר, ולכן המחשבון מבקש מספרים אחרים. הגדלת הנפח הכולל בדרך כלל פותרת זאת.

נפחים מוצגים עד שתי ספרות אחרי הנקודה, או עד שלוש כאשר נפח המקור קטן מ-0.01 mL, כך שנפח קטן לעולם לא יוצג כ-0.00 mL.

שאלות נפוצות

מהי הנוסחה לדילול תאים?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, כאשר C₁ ו-C₂ הם ריכוז המקור וריכוז היעד, ו-V₁ ו-V₂ הם הנפח שנלקח מהמקור והנפח הסופי הכולל.

האם ריכוז היעד יכול להיות גבוה יותר מריכוז המקור?

לא. דילול רק מוריד את הריכוז. כדי להגיע לריכוז גבוה יותר יש לסרכז את התאים ולהשהות אותם מחדש בנפח קטן יותר.

באיזה נוזל יש להשתמש לדילול תאים?

משתמשים במצע תרבית מלא כאשר התאים צריכים להישאר בריאים במשך שעות או ימים, למשל לפני זריעת צלחת. PBS או תמיסת מלח מאוזנת דומה מתאימים לדילולים קצרים, של פחות מכ-30 דקות, לפני עיבוד נוסף של התאים. משתמשים במצע נטול סרום כאשר חלבוני הסרום עלולים להפריע לבדיקה עוקבת.

האם הנוסחה מתאימה לחיידקים או לשמרים?

כן. C₁V₁ = C₂V₂ מתאים לכל תרחיף של חלקיקים, כולל חיידקים הנמדדים ביחידות יוצרות מושבות למיליליטר (CFU/mL), שמרים וחלקיקים נגיפיים הנמדדים ביחידות יוצרות פלאקים למיליליטר (PFU/mL), כל עוד משתמשים באותן יחידות בשני אגפי המשוואה.

האם יש לספור תאים מתים בדילול?

בעת זריעת תרבית חיה יש לספור רק תאים בני-חיות. אם תרחיף הוא בעל חיוניות של 80%, הריכוז החיוני שלו הוא 0.8 כפול מספירת התאים הכוללת, ויש להשתמש בריכוז החיוני הזה בתור C₁.

כיצד ניתן להכין דילולים גדולים מאוד במדויק?

דילולים גדולים, כגון דילול של 1 ל-1000, מבוצעים בדרך כלל כסדרה של שלבים קטנים יותר הנקראים דילולים עוקבים. שלושה דילולים עוקבים של 1 ל-10 מגיעים לדילול כולל של 1 ל-1000, תוך שמירה על כל שלב שאיבה בפיפטה בתוך טווח נפחים מדויק.