מחשבון ריכוז חלבון | A280 ל-mg/mL

מחשבון ריכוז חלבון

מחשבון ריכוז חלבון ממיר קריאת בליעת אור מספקטרופוטומטר לכמות החלבון המומס בתמיסה. התוצאה ניתנת בדרך כלל במיליגרמים למיליליטר (מ״ג/מ״ל) או במיקרוגרמים למיליליטר (μg/mL). החישוב מבוסס על חוק ביר–למברט, קשר בכימיה המקשר בין כמות האור שדוגמה בולעת לבין כמות החומר שהיא מכילה.

כיצד מודדים ריכוז חלבון

רוב החלבונים בולעים אור אולטרה־סגול בעוצמה רבה באורך גל של 280 ננומטר (נ״מ). בליעה זו נובעת בעיקר משתי חומצות אמינו, טריפטופן וטירוזין, המצויות במבנה החלבון. ספקטרופוטומטר מעביר אור דרך הדוגמה ומודד כמה ממנו הדוגמה בולעת. קריאה זו נקראת בליעה, או A280 כאשר היא נלקחת ב־280 נ״מ.

מדידת בליעה ב־280 נ״מ מהירה ואינה הורסת את הדוגמה. בכך היא שונה משיטות כימיות כגון בדיקת ברדפורד או BCA, המתוארות להלן. השיטה פועלת בצורה הטובה ביותר על חלבון מטוהר בתמיסה, עם קריאת בליעה שבין בקירוב 0.1 ל־1.0. קריאות מחוץ לטווח הזה אמינות פחות, ולכן לעיתים קרובות יש למהול את הדוגמה לפני המדידה.

נוסחת ריכוז החלבון

המחשבון מסדר מחדש את חוק ביר–למברט כדי לפתור עבור הריכוז:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — ריכוז החלבון, במ״ג/מ״ל
• A — בליעה ב־280 נ״מ (מספר טהור, ללא יחידה)
• DF — מקדם המיהול, מספר הפעמים שבהן הדוגמה המקורית נמהלה לפני המדידה
• ε — מקדם הבליעה המולרית, קבוע ייחודי לחלבון, ביחידות L/(g·cm)
• l — אורך המסלול, המרחק שהאור עובר דרך הדוגמה, בס״מ (בדרך כלל 1 cm בקובטה תקנית, מיכל קטן מזכוכית או מפלסטיק המשמש בספקטרופוטומטר)

כדי להמיר את התוצאה למיקרוגרמים למיליליטר, מכפילים את הערך במ״ג/מ״ל ב־1,000. כדי למצוא את המסה הכוללת של החלבון בדוגמה, מכפילים את הריכוז בנפח הדוגמה במיליליטרים.

דוגמה פתורה

דוגמה נותנת קריאת בליעה של 0.5 ב־280 נ״מ. היא לא נמהלה, ולכן מקדם המיהול הוא 1, והיא נמדדה בקובטה תקנית של 1 cm. החלבון הוא אלבומין בסרום בקר (BSA), שמקדם הבליעה המולרית שלו הוא 0.667 L/(g·cm).

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/מ״ל

בדוגמה בנפח 1 mL, מדובר בכ־0.75 mg חלבון כולל, או 750 μg/מ״ל.

מקדמי הכחדה מולריים של חלבונים נפוצים

כל חלבון בולע אור בצורה שונה, משום שלכל אחד מהם מספר שונה של שיירי טריפטופן וטירוזין. מקדם הבליעה המולרית מתאר זאת עבור חלבון מסוים ב־280 נ״מ, ביחידות של L/(g·cm). ערכים נפוצים כוללים:

מחשבון יכול לקבל גם מקדם הכחדה מולרי מותאם אישית עבור חלבון שאינו מופיע ברשימה זו. עבור חלבון שרצף חומצות האמינו שלו ידוע, ניתן להעריך ערך זה באמצעות נוסחה שפורסמה על ידי גיל ופון היפל בשנת 1989: ε₂₈₀ = (שיירי טריפטופן × 5,500) + (שיירי טירוזין × 1,490) + (שיירי ציסטין × 125). נוסחה זו נותנת תוצאה ביחידות M⁻¹cm⁻¹, יחידה מולרית, השונה מהערכים המבוססים על מסה ביחידות L/(g·cm) שלעיל. כלים חינמיים כגון ProtParam, המתארח בשרת ExPASy, מחשבים ערך זה ישירות מרצף החלבון.

אורך המסלול ומקדם המיהול

אורך המסלול הוא רוחב הקובטה שמכילה את הדוגמה, הנמדד בסנטימטרים. רוחבן של קובטות תקניות הוא 1 cm. ספקטרופוטומטרים למיקרו־נפחים, המודדים דוגמיות קטנות מאוד, עשויים להשתמש במסלול קצר בהרבה, כגון 0.1 cm.

מקדם המיהול מביא בחשבון כל מיהול שבוצע לפני המדידה. אם דוגמה מרוכזת הייתה נותנת בליעה מעל 1.0, מקובל למהול אותה תחילה באמצעות בופר. מקדם המיהול שווה לנפח המדולל הכולל חלקי נפח הדוגמה המקורית. לדוגמה, ערבוב 10 μL דוגמה עם 990 μL בופר נותן נפח כולל של 1,000 μL ומקדם מיהול של 100.

דרכים אחרות למדידת ריכוז חלבון

בליעה ב־280 נ״מ היא אחת מכמה שיטות נפוצות המשמשות במעבדה.

• בדיקת ברדפורד: משתמשת בצבע שמשנה את צבעו כאשר הוא נקשר לחלבון. היא פועלת היטב על דוגמיות לא מטוהרות, אך שינוי הצבע עשוי להשתנות בין חלבונים שונים.
• בדיקת BCA: מבוססת על שינוי צבע הנגרם מקשרי הפפטיד של החלבון. היא תואמת לשימוש עם חומרי ניקוי רבים, אך ביצועה אורך זמן רב יותר ממדידת בליעה ישירה.
• שיטת לורי: שיטה ותיקה יותר, רגישה מאוד, אך מגיבה בצורה לא טובה עם מרכיבים נפוצים מסוימים של בופרים.

כל אחת משלוש השיטות האלה הורסת את הדוגמה. מדידת A280 ישירה אינה הורסת אותה, ולכן אפשר לשחזר את אותה דוגמה ולהשתמש בה שוב.

שאלות נפוצות

מהו טווח הבליעה האידיאלי לשיטה זו?

בין 0.1 ל־1.0. מתחת ל־0.1, הקריאה אינה מדויקת. מעל 1.0, הקשר בין הבליעה לריכוז עלול להפסיק להיות קו ישר, ולכן יש למהול את הדוגמה תחילה.

מדוע למדוד ב־280 נ״מ במקום ב־260 נ״מ?

חומצות גרעין, כגון DNA ו־RNA, בולעות בעוצמה רבה ב־260 נ״מ. חלבונים בולעים יותר ב־280 נ״מ בגלל תכולת הטריפטופן והטירוזין שלהם. מדידה ב־280 נ״מ מפחיתה הפרעות מכל חומצות גרעין המצויות בדוגמה.

כיצד מוצאים את מקדם ההכחדה המולרי עבור חלבון שאינו מופיע ברשימה?

עבור חלבון שהרצף שלו ידוע, כלי כגון ProtParam מחשב אותו לפי מספר שיירי הטריפטופן, הטירוזין והציסטין. אפשר גם למדוד אותו ישירות, באמצעות השוואת הבליעה של הדוגמה לתמיסה בעלת ריכוז ידוע.

האם שיטה זו מתאימה לתערובת חלבונים?

היא מתאימה ביותר לחלבון יחיד שעבר טיהור, בעל מקדם הכחדה מולרי ידוע. תערובת של חלבונים לא ידועים, כגון ליזט תאים, נמדדת בדרך כלל באמצעות בדיקת ברדפורד או BCA, משום ששיטות אלה נותנות אומדן עקבי יותר של כמות החלבון הכוללת.

האם חומרי ניקוי עלולים להפריע לקריאה?

כן. חומרי ניקוי רבים בולעים אור בסביבת 280 נ״מ, דבר שעלול לעוות את התוצאה. שימוש בדוגמת ביקורת המכילה אותו ריכוז של חומר ניקוי מסייע לבטל את בליעת הרקע הזו. ריכוזים גבוהים מאוד של חומרי ניקוי עשויים לחייב שימוש בבדיקה התואמת לחומרי ניקוי, כגון BCA.