מחשבון חוק ביר-למברט - חשב ספיגה מיידית

מהו חוק ביר–למברט?

חוק ביר–למברט הוא נוסחה המתארת כמה אור תמיסה סופגת. הוא מקשר בין בליעה לבין שלושה גורמים: ריכוז התמיסה, עוצמת בליעת האור של החומר המומס, והמרחק שהאור עובר דרך הדגימה. הוא נקרא גם חוק ביר. מחשבון חוק ביר–למברט משתמש בנוסחה זו כדי למצוא בליעה, העברה ואחוז האור שנבלע מתוך כמה נתוני קלט פשוטים.

החוק הוא כלי מרכזי בספקטרוסקופיה, חקר האופן שבו חומר סופג ופולט אור. משתמשים בו מדי יום במעבדות לכימיה, ביולוגיה ורפואה כדי למדוד ריכוזי חומרים בתמיסה.

נוסחת חוק ביר–למברט

חוק ביר–למברט קובע:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A היא הבליעה, כלומר כמות האור שתמיסה סופגת באורך גל נתון. אין לה יחידות.
• ε (אפסילון) הוא מקדם הבליעה המולרי, הנקרא גם מקדם ההכחדה המולרי. הוא מודד עד כמה חומר סופג אור באורך גל מסוים. יחידות: L/(mol·cm).
• c הוא ריכוז החומר, ביחידות mol/L (מולריות).
• l הוא אורך המסלול, כלומר המרחק שהאור עובר דרך הדגימה, ביחידות cm.

הבליעה קשורה למעבירות, כלומר לחלק היחסי של האור העובר דרך הדגימה:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

כאן T היא ההעברה, מספר בין 0 ל־1. הכפלת T ב־100 נותנת את אחוז האור שהועבר. אחוז האור שנבלע הוא:

$\text{אחוז האור שנבלע} = (1 - T) \times 100\%$

לדוגמה, בליעה של 1.0 פירושה T = 0.1, ולכן 90% מהאור נבלע. בליעה של 2.0 פירושה T = 0.01, ולכן 99% נבלע.

כיצד מחשבים בליעה

כדי למצוא את הבליעה באמצעות המחשבון, מזינים שלושה ערכים:

1. אורך המסלול (l) — רוחב מיכל הדגימה, בדרך כלל קיווטה. רוחבן של רוב הקיווטות התקניות הוא 1 cm, אך יש קיווטות מיוחדות שרוחבן 0.1 cm או 10 cm.
2. בליעה מולרית (ε) — תכונה של החומר המסוים באורך גל מסוים. בדרך כלל מוצאים אותה בטבלאות ייחוס שפורסמו או מחשבים אותה ממבנה המולקולה. חלבונים, למשל, סופגים אור סביב 280 nm בזכות שתי חומצות אמינו, טריפטופן וטירוזין, והערך המדויק תלוי במספר החומצות האלה בחלבון.
3. ריכוז (c) — כמות החומר המומס, ביחידות mol/L. יש להמיר תחילה ריכוזים הנתונים ביחידות אחרות, כגון mg/mL, באמצעות המסה המולרית של המולקולה.

המחשבון מכפיל את שלושת המספרים כדי לקבל את הבליעה, ולאחר מכן מחשב מהתוצאה את ההעברה ואת אחוז האור שנבלע.

דוגמה פתורה

חוקר מטהר חלבון וצריך לבדוק את ריכוזו לפני ביצוע ניסוי. הבליעה המולרית של החלבון ב־280 nm ידועה מתוך הרצף שלו: ε = 44,000 L/(mol·cm). החוקר מודד את הדגימה בקיווטה תקנית של 1 cm ומקבל בליעה של A = 0.523.

סידור מחדש של הנוסחה כדי לפתור עבור הריכוז:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

זהו ריכוז של 11.9 מיקרומולר (μM). ערך זה נמצא בטווח שבו מכשירים מספקים את המדידות המדויקות ביותר, ולכן החוקר יכול לסמוך על התוצאה בלי למהול את הדגימה נוספת.

פירוש ערכי הבליעה

• A = 0: שום אור אינו נבלע באורך גל זה.
• A = 0.3 עד 0.9: הטווח שבו רוב הספקטרופוטומטרים מספקים את המדידות המדויקות והליניאריות ביותר.
• A = 1.0: 90% מהאור נבלע, ו־10% מועבר.
• A = 2.0: 99% נבלע, ו־1% מועבר.
• A מעל 2.5: מחוץ לטווח האמין של רוב המכשירים. יש למהול את הדגימה ולמדוד אותה מחדש.

קריאות הנמוכות בערך מ־0.3 מושפעות מרעש המכשיר. קריאות הגבוהות בערך מ־1.5 מושפעות מכמויות קטנות של אור תועה בתוך המכשיר, הגורמות לשגיאה. דילול הדגימה ומדידה חוזרת הם הפתרון המקובל כאשר הקריאה נמצאת מחוץ לטווח המדויק.

היכן משתמשים בחוק ביר–למברט

כימיה אנליטית. מעבדות מודדות את הבליעה של דגימה ומשתמשות בנוסחה כדי לחשב לאחור ריכוז לא ידוע. הדבר נפוץ בבדיקת רמות ניטראט, פוספט ויוני מתכת במים, וכן בבדיקת ריכוזה של אצווה כימית במהלך הייצור.

ביוכימיה. בליעה ב־280 nm משמשת להערכת ריכוז חלבון. בליעה ב־260 nm משמשת להערכת ריכוז DNA או RNA; לפי המקובל, בליעה של 1.0 תואמת בקירוב ל־50 μg/mL של DNA דו־גדילי או ל־40 μg/mL של RNA. היחס בין שתי הקריאות (A260/A280) מספק מדד גס לטוהר הדגימה.

תרופות. יצרני תרופות משתמשים בקריאות בליעה כדי לבדוק באיזו מהירות טבליה משחררת את החומר הפעיל שלה, ולעקוב אחר התפרקות תרופה במהלך אחסון.

רפואה. מכשירים אוטומטיים רבים לבדיקות דם מודדים בליעה הנובעת מתגובות כימיות המשנות צבע, כדי לדווח על רמות גלוקוז, אנזימי כבד ובילירובין.

מזון ומשקאות. צבע הבירה נמדד באמצעות בליעה ב־430 nm לפי שיטת אמנת מבשלות הבירה האירופית (EBC). שיטות דומות משמשות לבדיקת צבע של יין ושל משקאות קלים.

מגבלות חוק ביר–למברט

החוק מניח שהאור הוא באורך גל יחיד ומדויק ושהדגימה אינה מפזרת אור. הוא אינו מתקיים בכמה מצבים נפוצים:

• ריכוז גבוה. מעל בערך 0.01 mol/L, מולקולות מומסות מתחילות ליצור אינטראקציות זו עם זו, והבליעה מפסיקה לעלות באופן ליניארי עם הריכוז.
• דגימות עכורות או המכילות חלקיקים. תרחיפים ונוזלים עכורים מפזרים אור נוסף על ספיגתו, ולכן מגדילים את קריאת הבליעה. חוק ביר–למברט אינו מביא בחשבון פיזור; עבור דגימות אטומות או מפזרות, כגון אבקות, משתמשים במודל קשור הנקרא תיאוריית קובלקה–מונק.
• שינויים כימיים במהלך המדידה. חומרים מסוימים מתפרקים באור או משתנים עם ה־pH בזמן המדידה, ולכן הקריאה משתנה במהלכה.
• שינויי טמפרטורה. מקדם הבליעה המולרי תלוי בטמפרטורה, ולכן קריאות שנלקחו בטמפרטורות לא עקביות אינן ניתנות להשוואה ישירה.

היסטוריה

החוק התפתח במשך יותר ממאה שנה בזכות עבודתם של שלושה מדענים. פייר בוגה תיאר ב־1729 כיצד כל שכבה בעובי שווה של חומר סופגת חלק שווה מהאור העובר דרכה. יוהאן היינריך למברט ניסח מחדש את הקשר באופן מתמטי בספרו Photometria משנת 1760, והראה שהבליעה עולה ביחס ישר לאורך המסלול. אוגוסט ביר הרחיב את החוק ב־1852 והראה שהבליעה עולה גם ביחס ישר לריכוז. החוק המשולב נקרא לעיתים חוק בוגה–ביר–למברט, כהכרה בתרומתם של שלושתם.

שאלות נפוצות

למה משמש חוק ביר–למברט? הוא מחשב כמה אור תמיסה סופגת, ופועל גם בכיוון ההפוך כדי למצוא ריכוז לא ידוע מתוך בליעה שנמדדה. לכן הוא הבסיס לספקטרופוטומטריית UV-Vis, שיטה מעבדתית נפוצה למדידת כמותו של חומר בתמיסה.

באילו יחידות משתמשים בחוק ביר–למברט? אורך המסלול נמדד בסנטימטרים, הבליעה המולרית ביחידות L/(mol·cm), והריכוז ביחידות mol/L. לבליעה עצמה אין יחידות, אף שלעיתים מסמנים אותה "AU", כלומר יחידות בליעה. שימוש ביחידות אחרות בנוסחה בלי להמיר אותן תחילה מוביל לתוצאה שגויה.

מדוע קריאת הבליעה שלי אינה פרופורציונלית לריכוז? הגורמים הנפוצים ביותר הם ריכוז הגבוה בערך מ־0.01 mol/L, דגימה עכורה או המכילה חלקיקים, או קריאה הנמצאת הרחק מחוץ לטווח 0.3–0.9 שבו המכשירים מדויקים ביותר. דילול הדגימה ומדידה חוזרת בדרך כלל מאפשרים לזהות את הגורם הרלוונטי.

מה ההבדל בין בליעה להעברה? העברה היא החלק היחסי של האור העובר דרך דגימה. בליעה היא הלוגריתם השלילי בבסיס 10 של ההעברה: A = −log₁₀(T). ככל שהבליעה עולה, ההעברה יורדת.

מה ההבדל בין בליעה לצפיפות אופטית? מדובר באותה גודל פיזיקלי. המונח "צפיפות אופטית" משמש לעיתים קרובות יותר בביולוגיה, ואילו "בליעה" נפוץ יותר בכימיה.

איזה טווח בליעה הוא המדויק ביותר? בערך 0.3 עד 0.9. מתחת לטווח זה רעש המכשיר שולט באות. מעל בערך 1.5 אור תועה בתוך המכשיר גורם לשגיאה, ומעל בערך 2.5 רוב המכשירים אינם יכולים לספק קריאה אמינה כלל.

מקורות

1. ביר, א'. (1852). "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten." Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. סווינהרט, ד'. פ'. (1962). "The Beer-Lambert Law." Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. מאיירהופר, ט'. ג', פאלוב, ס', ופופ, י'. (2020). "The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure." ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.