מחשבון עקומת כיול | רגרסיה לינארית לניתוח מעבדתי

מהו מחשבון עקומת כיול

מחשבון עקומת כיול ממיר קריאות של מכשיר לריכוזים. הוא עושה זאת באמצעות התאמת קו ישר לנקודות נתונים מתמיסות תקן בריכוז ידוע, ולאחר מכן משתמש בקו זה כדי להמיר קריאה חדשה לריכוז. מעבדות משתמשות בעקומות כיול בכימיה, בביולוגיה ובבדיקות סביבתיות בכל פעם שמכשיר מדווח על אות, כגון בליעה או שטח פסגה, במקום לדווח ישירות על ריכוז.

המחשבון בדף זה מתאים קו באמצעות רגרסיה ליניארית, בשיטת הריבועים הפחותים. הוא מדווח על השיפוע, על החותך ועל R², מדד למידת הקִרבה שבה הנקודות עוקבות אחר הקו. לאחר מכן הוא יכול להעריך את הריכוז של דגימה לא ידועה מתוך תגובה שנמדדה.

נוסחת עקומת הכיול

עקומת כיול מניחה קשר ליניארי בין הריכוז לבין תגובת המכשיר:

$y = mx + b$

• $y$ הוא התגובה (מה שהמכשיר מודד)
• $x$ הוא הריכוז
• $m$ הוא השיפוע
• $b$ הוא חותך ציר ה־y

כיצד לחשב את השיפוע ואת החותך

עבור קבוצה של $n$ נקודות, השיפוע והחותך המתאימים ביותר לנתונים (במובן של ריבועים פחותים) הם:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

כאן $\bar{x}$ ו־$\bar{y}$ הם הריכוז הממוצע והתגובה הממוצעת של כל הנקודות.

נוסחת R²

R², מקדם הקביעה, מראה עד כמה הקו מתאים לנתונים:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ הוא התגובה שהקו חוזה עבור כל $x_i$. R² נע בין 0 ל־1. ערך של 1 פירושו שכל נקודה נמצאת בדיוק על הקו.

נוסחת הריכוז הלא ידוע

לאחר שהשיפוע והחותך ידועים, ניתן להמיר תגובה שנמדדה $y$ בחזרה לריכוז:

$x = \frac{y - b}{m}$

אם חישוב זה נותן מספר שלילי, המחשבון מדווח על הריכוז כ־0, מכיוון שריכוז שלילי אינו בעל משמעות פיזיקלית. הוא מדווח גם על 0 כאשר השיפוע שהותאם הוא 0, משום שקו אופקי אינו מספק מידע על הריכוז.

דוגמה פתורה

נניח שארבעה תקנים נותנים את התוצאות הבאות:

הריכוז הממוצע הוא 3 והתגובה הממוצעת היא 0.20.

שיפוע:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

חותך:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: השוואת התגובות החזויות לתגובות בפועל נותנת R² = 0.9966.

הקו שהותאם הוא:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

כעת נניח שדגימה לא ידועה נותנת תגובה של 0.20. הריכוז שלה הוא:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

כיצד להשתמש במחשבון זה

1. הזינו את הריכוז הידוע של כל תקן ואת התגובה שנמדדה עבורו, כצמד מספרים. המחשבון מתחיל בשתי שורות.
2. בחרו באפשרות "הוספת נקודת נתונים" כדי להזין תקנים נוספים, או ב"הסרת נקודת נתונים" לצד שורה כדי למחוק אותה. נדרשות לפחות שתי נקודות.
3. לאחר שמולאו לפחות שתי נקודות, המחשבון מציג את משוואת הרגרסיה, את ערך R² ואת גרף הנקודות עם הקו שהותאם. השיפוע, החותך, R² והריכוז מעוגלים כולם לארבע ספרות אחרי הנקודה לצורכי תצוגה.
4. הזינו תגובה שנמדדה תחת "חישוב ריכוז לא ידוע" כדי לראות את הריכוז המתאים. התוצאה מתעדכנת אוטומטית בזמן הקלדת הערך; אין כפתור נפרד שיש ללחוץ עליו.
5. בחרו ב"איפוס" כדי למחוק את כל הנקודות שהוזנו ואת שדה התגובה ולהתחיל מחדש.

פירוש השיפוע, החותך ו־R²

השיפוע מראה בכמה משתנה התגובה לכל יחידת ריכוז. שיפוע גדול יותר פירושו שהשיטה מגיבה בעוצמה רבה יותר לשינויים קטנים בריכוז.

החותך הוא התגובה החזויה בריכוז אפס. הוא משקף אות רקע, כגון דגימת ריק או קו בסיס של המכשיר. חותך שאינו אפס נפוץ ואינו מהווה בהכרח בעיה, אך חותך גדול או לא עקבי בין כיולים עשוי להצביע על זיהום או על תקלה במכשיר.

R² מראה עד כמה הנקודות עוקבות אחר קו ישר. ערכים מעל 0.99 אופייניים לשיטה ליניארית המתפקדת כראוי. R² נמוך יותר עשוי להצביע על שגיאת פיפטציה, על תקן שהתפרק או על טווח ריכוזים שבו התגובה כבר אינה ליניארית.

היכן משתמשים בעקומות כיול

עקומות כיול נפוצות בכל מקום שבו יש להמיר את האות הגולמי של מכשיר לריכוז:

• ספקטרופוטומטריה — מודדים את בליעת האור וממירים אותה לריכוז, למשל בעת מדידת תכולת חלבון או פיגמנט.
• כרומטוגרפיה (HPLC, GC) — שטח הפסגה או גובהה בכרומטוגרמה מומרים לריכוז, שימוש נפוץ בבדיקות סמים ובניתוח סביבתי.
• ELISA ובדיקות אימונולוגיות אחרות — עוצמת הצבע או הפלואורסצנציה מקורא פלטה מומרת לריכוז האנטיגן או הנוגדן.
• qPCR — ערכי סף המחזור מדילולים סדרתיים של דגימה ידועה יוצרים עקומה המשמשת לאמידת כמות החומר הגנטי בדגימה לא ידועה.

כאשר קו ישר אינו מתאים

שיטות מסוימות אינן ליניאריות לכל אורך הטווח שלהן. פתרונות נפוצים כוללים הגבלת הכיול לאזור צר וליניארי יותר, החלת טרנספורמציה לוגריתמית לפני התאמת קו, שימוש בהתאמה פולינומית (מעוקלת), או שימוש ברגרסיה משוקללת כאשר שגיאת המדידה גדלה או קטנה עם הריכוז. מחשבון זה מתאים רק קו ישר; אם הנקודות יוצרות בבירור עקומה, התוצאות יהיו פחות אמינות וייתכן שיידרש מודל אחר.

שאלות נפוצות

מהי עקומת כיול?

עקומת כיול היא קו המותאם לקריאות של מכשיר עבור דגימות בעלות ריכוז ידוע. משתמשים בה כדי להמיר קריאה חדשה, מדגימה בעלת ריכוז לא ידוע, לערך ריכוז.

כמה נקודות נתונים דרושות לעקומת כיול?

המחשבון זקוק לפחות לשתי נקודות כדי להתאים קו, אך שתי נקודות אינן יכולות להראות אם הקשר האמיתי אכן ישר. רוב המעבדות משתמשות בחמישה עד שמונה תקנים הפרוסים על פני הטווח הצפוי של הדגימות הלא ידועות.

מה המשמעות של R² בעקומת כיול?

R² מודד עד כמה נקודות הנתונים עוקבות אחר הקו שהותאם, בסולם שבין 0 ל־1. ערך של 1 פירושו שכל נקודה נמצאת בדיוק על הקו. ערכים מעל 0.99 נחשבים בדרך כלל עדות חזקה לקשר ליניארי.

האם ניתן להעריך ריכוזים מחוץ לטווח התקנים?

הערכת ריכוז הנמוך מהתקן הנמוך ביותר או הגבוה מהתקן הגבוה ביותר אינה אמינה, משום שאין נתונים המאשרים שהקו נשאר ישר שם. עדיף למהול דגימה שהקריאה שלה גבוהה מדי, או להגדיל את ריכוזה של דגימה שהקריאה שלה נמוכה מדי, ולמדוד מחדש בתוך טווח הכיול.

מדוע הריכוז המחושב מוצג לפעמים כ־0?

אם תגובה שנמדדה נמוכה מהחותך שהותאם (בשיפוע חיובי), הנוסחה $x = (y - b) / m$ נותנת מספר שלילי. במקרה כזה המחשבון מציג 0, מכיוון שריכוז ממשי אינו יכול להיות שלילי. הוא מציג גם 0 כאשר השיפוע הוא 0, מצב המתרחש אם לכל התקנים יש אותה תגובה או אם לכל התקנים יש אותו ריכוז.

מהו ההבדל בין השיפוע לנקודת החיתוך?

השיפוע מתאר עד כמה התגובה רגישה לשינוי בריכוז. החותך הוא התגובה החזויה בריכוז אפס, ולעיתים קרובות הוא משקף אות רקע ולא את האנליט עצמו.