Kalkulator broja kopija DNA-a | Alat za genomsku analizu

Kalkulator broja kopija DNA

Kalkulator broja kopija DNA procjenjuje koliko kopija ciljne sekvence postoji u uzorku DNA. Radi na temelju koncentracije uzorka, njegova volumena i učestalosti pojavljivanja ciljne sekvence unutar dulje sekvence DNA. Laboratoriji molekularne biologije takvu procjenu koriste za planiranje eksperimenata kao što je qPCR (kvantitativna lančana reakcija polimerazom) prije izvođenja skuplje i preciznije analize.

Što znači broj kopija DNA

Broj kopija DNA jest broj pojavljivanja određene sekvence u genomu ili uzorku. Tipičan ljudski gen pojavljuje se dvaput, jednom naslijeđen od svakog roditelja. Taj broj mogu promijeniti različiti čimbenici.

• Amplifikacija: više od dvije kopije. Stanice raka često umnažaju gene koji potiču rast, kao što je HER2 u nekim tumorima dojke.
• Delecija: manje od dvije kopije, a ponekad nijedna. Delecije mogu uzrokovati genetske poremećaje.
• Dupliciranje: pojavljuje se dodatna kopija ondje gdje bi trebala biti samo jedna ili dvije.
• Varijacija broja kopija (CNV): uobičajena razlika u broju kopija među pojedincima, prisutna u znatnom dijelu ljudskog genoma.

Formula za broj kopija DNA

Kalkulator pretvara broj pojavljivanja sekvence i masu uzorka u broj kopija pomoću ove formule:

$\text{Broj kopija} = \frac{\text{Pojavljivanja} \times \text{Koncentracija} \times \text{Volumen} \times N_A}{\text{Duljina DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Gdje:

• Pojavljivanja — koliko se puta ciljna sekvenca pojavljuje u cjelokupnoj sekvenci DNA, pri čemu se preklapajuća podudaranja broje zasebno.
• Koncentracija — koncentracija DNA u nanogramima po mikrolitru (ng/μL), koja se obično očitava spektrofotometrom ili fluorometrom.
• Volumen — volumen uzorka u mikrolitrima (μL).
• $N_A$ — Avogadrov broj, 6,022 × 10²³ molekula po molu. Pretvara količinu DNA izraženu u molovima u broj molekula.
• Duljina DNA — duljina cjelokupne sekvence DNA, izražena u parovima baza.
• 660 — prosječna molekulska masa jednog para baza DNA, u gramima po molu (g/mol). Par baza čine dva uparena nukleotida, po jedan iz svakog lanca DNA.
• 10⁹ — pretvara nanograme u grame.

Formula najprije pretvara masu uzorka u količinu molekula DNA izraženu u molovima, zatim je množi Avogadrovim brojem kako bi dobila ukupan broj molekula DNA u uzorku, a potom taj broj množi brojem pojavljivanja ciljne sekvence u svakoj molekuli.

Alat prihvaća samo slova A, T, C i G. Razmaci i prijelomi redaka zanemaruju se, a mala slova računaju se jednako kao velika.

Kako izračunati broj kopija DNA: primjer s izračunom

Uzmimo DNA sekvencu od 12 parova baza, ATCGATCGATCG, s ciljnom sekvencom ATCG, koncentracijom 10 ng/μL i volumenom 20 μL.

Korak 1: prebrojite pojavljivanja. ATCG pojavljuje se 3 puta u ATCGATCGATCG (na položajima 1, 5 i 9).

Korak 2: odredite ukupnu masu DNA. Koncentracija × volumen = 10 × 20 = 200 ng.

Korak 3: pretvorite u molove. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Podijelite s (12 parova baza × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Dobiva se 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Korak 4: pretvorite u broj molekula. Pomnožite s Avogadrovim brojem: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekula/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molekula DNA.

Korak 5: pomnožite s brojem pojavljivanja. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, odnosno približno 45.621.212.121.212 kopija.

Taj broj izgleda golem jer uzorak od 20 μL pri 10 ng/μL i dalje sadržava bilijune kratkih molekula DNA. U stvarnim se uzorcima obično koriste mnogo dulje sekvence, što smanjuje broj molekula pri istoj masi.

Gdje se koristi analiza broja kopija DNA

Dijagnostika raka. Patološki laboratoriji provjeravaju broj kopija HER2 u tkivu tumora dojke. Normalna stanica nosi dvije kopije. Amplificirani tumor može ih imati šest ili više, što utječe na mogućnost primjene ciljanih lijekova kao što je trastuzumab.

Testiranje genetskih bolesti. Stanja poput DiGeorgeova sindroma uključuju deleciju segmenta kromosoma. Downov sindrom uključuje dodatnu kopiju kromosoma 21 (trisomija 21). Prebrojavanje kopija pomaže potvrditi te dijagnoze.

Kvantifikacija transgena i plazmida. Istraživači provjeravaju koliko je kopija umetnutog gena dospjelo u biljnu, životinjsku ili bakterijsku stanicu. Obično se preferira jedna kopija jer više kopija može potaknuti stanicu da utiša gen.

Praćenje patogena i virusnog opterećenja. Procjene broja kopija prate količinu virusne ili bakterijske DNA prisutne u uzorku, što se koristi za praćenje infekcija i ispitivanje okoliša.

Druge metode mjerenja broja kopija

Ovaj kalkulator daje brzu procjenu na temelju podataka o sekvenci i koncentraciji. Laboratoriji kojima je potrebna veća preciznost obično koriste jednu od sljedećih metoda:

• Kvantitativni PCR (qPCR): umnaža i mjeri DNA u stvarnom vremenu; uz dobru standardnu krivulju točan je približno 15–20%.
• Digitalni PCR (dPCR): dijeli uzorak na tisuće sitnih reakcija radi izravnog prebrojavanja, bez potrebe za standardnom krivuljom.
• Hibridizacija in situ fluorescencijom (FISH): vizualno izravno prebrojava sekvence pod mikroskopom na stanicama ili kromosomima; standardna je metoda u mnogim laboratorijima za dijagnostiku raka.
• Sekvenciranje nove generacije (NGS): sekvencira cijeli uzorak i istodobno profilira broj kopija duž cijelog genoma.

Često postavljana pitanja

Što je broj kopija DNA? To je broj pojavljivanja određene sekvence DNA u genomu ili uzorku. Većina ljudskih gena pojavljuje se dvaput, jednom od svakog roditelja. Dodatne kopije ili njihov nedostatak mogu utjecati na zdravlje i rizik od bolesti.

Koliko je ovaj kalkulator precizan? Daje teorijsku procjenu na temelju unesenih podataka, a ne laboratorijsko mjerenje. Preciznost ovisi o tome koliko je točno izmjerena koncentracija i koliko je ciljna sekvenca specifična. Metode poput digitalnog PCR-a preciznije su za objavljene rezultate.

Može li se ovaj kalkulator koristiti za RNA? Ne. RNA umjesto timina sadržava uracil i ima drugačiji šećer, pa se njezina molekulska masa razlikuje od molekulske mase DNA. RNA ima prosječnu molekulsku masu od približno 330 g/mol po nukleotidu, u usporedbi s približno 660 g/mol po paru baza DNA. Primjena formule za DNA na podatke o RNA dala bi pogrešan rezultat.

Zašto se preklapajuća sekvenca broji više puta? Kalkulator broji svaki položaj na kojem se ciljna sekvenca podudara, čak i ako podudaranja dijele slova. U ATATAT sekvenca ATA podudara se dvaput, na položaju 1 i položaju 3, jer se svaki početni položaj provjerava zasebno.

Koji raspon koncentracije DNA najbolje funkcionira? Koncentracije od 10–100 ng/μL daju najpouzdanija očitanja na standardnim laboratorijskim instrumentima. Ispod 10 ng/μL pogreška mjerenja raste pa se umjesto standardnog spektrofotometra preporučuje osjetljivija metoda, poput fluorometra.

Može li ovaj kalkulator procijeniti broj kopija plazmida? Da. Unesite cijelu sekvencu plazmida kao sekvencu DNA, a jedinstvenu regiju inserta kao ciljnu sekvencu, zajedno s izmjerenom koncentracijom plazmida i volumenom uzorka.