Calcolatore del Numero di Copie del DNA | Strumento di Analisi Genomica

Calcolatore del numero di copie del DNA

Un calcolatore del numero di copie del DNA stima quante copie di una sequenza bersaglio sono presenti in un campione di DNA. Utilizza la concentrazione e il volume del campione, oltre alla frequenza con cui la sequenza bersaglio compare all'interno della sequenza di DNA più lunga. I laboratori di biologia molecolare usano questo tipo di stima per pianificare esperimenti come la qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa) prima di eseguire un'analisi più costosa e precisa.

Che cosa indica il numero di copie del DNA

Il numero di copie del DNA è il numero di volte in cui una sequenza specifica compare in un genoma o in un campione. Un tipico gene umano compare due volte, una volta ereditato da ciascun genitore. Diversi fattori possono modificare questo numero.

• Amplificazione: più di due copie. Le cellule tumorali amplificano spesso geni che favoriscono la crescita, come HER2 in alcuni tumori della mammella.
• Delezione: meno di due copie, talvolta nessuna. Le delezioni possono causare malattie genetiche.
• Duplicazione: compare una copia aggiuntiva dove dovrebbe essercene soltanto una o due.
• Variazione del numero di copie (CNV): una normale differenza nel numero di copie tra individui, presente in una parte significativa del genoma umano.

Formula del numero di copie del DNA

Il calcolatore converte il numero di occorrenze della sequenza e la massa del campione in un numero di copie mediante questa formula:

$\text{Numero di copie} = \frac{\text{Occorrenze} \times \text{Concentrazione} \times \text{Volume} \times N_A}{\text{Lunghezza del DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Dove:

• Occorrenze — il numero di volte in cui la sequenza bersaglio compare nella sequenza completa del DNA; le corrispondenze sovrapposte vengono conteggiate separatamente.
• Concentrazione — concentrazione del DNA in nanogrammi per microlitro (ng/μL), generalmente misurata con uno spettrofotometro o un fluorometro.
• Volume — volume del campione in microlitri (μL).
• $N_A$ — numero di Avogadro, 6,022 × 10²³ molecole per mole. Converte le moli di DNA in un numero di molecole.
• Lunghezza del DNA — lunghezza della sequenza completa del DNA, espressa in coppie di basi.
• 660 — massa molecolare media di una coppia di basi del DNA, in grammi per mole (g/mol). Una coppia di basi è formata da due nucleotidi appaiati, uno per ciascun filamento di DNA.
• 10⁹ — converte i nanogrammi in grammi.

La formula converte innanzitutto la massa del campione in moli di molecole di DNA, moltiplica per il numero di Avogadro per ottenere il numero totale di molecole di DNA nel campione e quindi moltiplica per il numero di volte in cui la sequenza bersaglio compare in ciascuna molecola.

Lo strumento accetta soltanto le lettere A, T, C e G. Gli spazi e le interruzioni di riga vengono ignorati e le lettere minuscole sono considerate equivalenti alle maiuscole.

Come calcolare il numero di copie del DNA: esempio svolto

Si consideri una sequenza di DNA di 12 coppie di basi, ATCGATCGATCG, con una sequenza bersaglio ATCG, una concentrazione di 10 ng/μL e un volume di 20 μL.

Passaggio 1: contare le occorrenze. ATCG compare 3 volte in ATCGATCGATCG (alle posizioni 1, 5 e 9).

Passaggio 2: trovare la massa totale del DNA. Concentrazione × volume = 10 × 20 = 200 ng.

Passaggio 3: convertire in moli. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Dividendo per (12 coppie di basi × 660 g/mol) = 7.920 g/mol, si ottiene 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Passaggio 4: convertire in numero di molecole. Moltiplicando per il numero di Avogadro: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molecole/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molecole di DNA.

Passaggio 5: moltiplicare per le occorrenze. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, ossia circa 45.621.212.121.212 copie.

Questo numero sembra enorme perché un campione di 20 μL a 10 ng/μL contiene comunque migliaia di miliardi di molecole di DNA corte. I campioni reali utilizzano generalmente sequenze molto più lunghe, il che riduce il numero di molecole a parità di massa.

Dove viene utilizzata l'analisi del numero di copie del DNA

Diagnosi oncologica. I laboratori di anatomia patologica verificano il numero di copie di HER2 nel tessuto tumorale della mammella. Una cellula normale contiene due copie. Un tumore amplificato può contenerne sei o più, influenzando l'idoneità a farmaci mirati come il trastuzumab.

Test per le malattie genetiche. Condizioni come la sindrome di DiGeorge comportano la delezione di un segmento cromosomico. La sindrome di Down comporta una copia aggiuntiva del cromosoma 21 (trisomia 21). Il conteggio delle copie contribuisce a confermare queste diagnosi.

Quantificazione di transgeni e plasmidi. I ricercatori verificano quante copie di un gene inserito sono entrate in una cellula vegetale, animale o batterica. Di solito si preferisce una singola copia, perché più copie possono indurre la cellula a silenziare il gene.

Monitoraggio dei patogeni e della carica virale. Le stime del numero di copie indicano la quantità di DNA virale o batterico presente in un campione; questo dato viene utilizzato nel monitoraggio delle infezioni e nelle analisi ambientali.

Altri metodi per misurare il numero di copie

Questo calcolatore fornisce una stima rapida basata sui dati relativi alla sequenza e alla concentrazione. I laboratori che necessitano di maggiore precisione utilizzano generalmente uno dei seguenti metodi:

• PCR quantitativa (qPCR): amplifica e misura il DNA in tempo reale; con una buona curva standard, raggiunge una precisione di circa 15–20%.
• PCR digitale (dPCR): suddivide un campione in migliaia di piccole reazioni per eseguire un conteggio diretto, senza bisogno di una curva standard.
• Ibridazione fluorescente in situ (FISH): conta visivamente le sequenze al microscopio direttamente nelle cellule o sui cromosomi; è il metodo standard in molti laboratori di diagnostica oncologica.
• Sequenziamento di nuova generazione (NGS): sequenzia l'intero campione e determina il profilo del numero di copie in tutto il genoma in una sola volta.

Domande frequenti

Che cos'è il numero di copie del DNA? È il numero di volte in cui una determinata sequenza di DNA compare in un genoma o in un campione. La maggior parte dei geni umani compare due volte, una volta per ciascun genitore. Copie aggiuntive o mancanti possono influire sulla salute e sul rischio di malattia.

Quanto è preciso questo calcolatore? Fornisce una stima teorica basata sui dati inseriti, non una misurazione di laboratorio. La precisione dipende dall'accuratezza con cui è stata misurata la concentrazione e dalla specificità della sequenza bersaglio. Per risultati destinati alla pubblicazione, metodi come la PCR digitale sono più precisi.

È possibile utilizzare questo calcolatore per l'RNA? No. L'RNA utilizza l'uracile invece della timina e uno zucchero diverso, quindi la sua massa molecolare differisce da quella del DNA. L'RNA ha una massa molecolare media di circa 330 g/mol per nucleotide, rispetto a circa 660 g/mol per coppia di basi del DNA. L'applicazione della formula del DNA ai dati dell'RNA produrrebbe un risultato errato.

Perché una sequenza sovrapposta viene conteggiata più di una volta? Il calcolatore conta ogni posizione in cui la sequenza bersaglio corrisponde, anche se le corrispondenze condividono alcune lettere. In ATATAT, la sequenza ATA corrisponde due volte, alla posizione 1 e alla posizione 3, perché ogni posizione iniziale viene verificata indipendentemente.

Quale intervallo di concentrazione del DNA funziona meglio? Le concentrazioni di 10–100 ng/μL forniscono le letture più affidabili con gli strumenti standard di laboratorio. Al di sotto di 10 ng/μL, l'errore di misurazione aumenta e si raccomanda un metodo più sensibile, come un fluorometro, invece di uno spettrofotometro standard.

Questo calcolatore può stimare il numero di copie di un plasmide? Sì. Inserire la sequenza completa del plasmide come sequenza di DNA e una regione unica dell'inserto come sequenza bersaglio, insieme alla concentrazione misurata del plasmide e al volume del campione.