Calcolatore della Temperatura di Appaiamento del DNA | Strumento Tm PCR Gratuito

Che cos'è un calcolatore della temperatura di annealing del DNA?

Un calcolatore della temperatura di appaiamento del DNA stima la temperatura di fusione (Tm) di un primer di DNA a partire dalla sua sequenza. La Tm è la temperatura alla quale metà delle molecole di primer è legata al filamento bersaglio e l'altra metà no. Nella reazione a catena della polimerasi (PCR), questo valore guida la scelta della temperatura utilizzata affinché i primer si leghino allo stampo di DNA.

Perché la temperatura di annealing è importante nella PCR

La PCR copia un segmento bersaglio di DNA attraverso cicli ripetuti di riscaldamento e raffreddamento. Ogni ciclo comprende tre fasi. Per prima cosa, il calore separa lo stampo a doppio filamento a circa 95 °C. Questa fase è chiamata denaturazione. In secondo luogo, la reazione si raffredda fino alla temperatura di annealing, generalmente compresa tra 50 °C e 65 °C, consentendo ai primer corti di legarsi alle sequenze complementari sui filamenti singoli. In terzo luogo, la temperatura sale a circa 72 °C e un enzima chiamato DNA polimerasi estende i primer per costruire nuovi filamenti di DNA.

Se la temperatura di annealing è troppo bassa, i primer si legano a sequenze solo parzialmente complementari, producendo frammenti di DNA aggiuntivi e indesiderati. Se è troppo alta, i primer non riescono a formare un legame stabile con lo stampo e viene copiato poco DNA o non ne viene copiato affatto. La temperatura di annealing è una delle prime impostazioni che i ricercatori modificano quando una reazione di PCR non funziona.

In che modo il contenuto in GC influenza la Tm

Un primer si lega alla sequenza bersaglio mediante legami a idrogeno. Una coppia guanina-citosina (G-C) forma tre legami a idrogeno. Una coppia adenina-timina (A-T) ne forma due. Un primer con una maggiore quantità di basi G e C richiede più calore per separarsi, quindi ha una Tm più elevata rispetto a un primer della stessa lunghezza con una maggiore quantità di basi A e T. Il contenuto in GC viene generalmente espresso come percentuale: il numero di basi G e C diviso per la lunghezza totale della sequenza, moltiplicato per 100.

Formula per la temperatura di appaiamento del DNA

Questo calcolatore applica una delle due formule, scelta in base alla lunghezza del primer.

Per primer di 14 nucleotidi o più lunghi, utilizza la formula del contenuto in GC di Marmur-Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Qui N_GC è il numero di basi G e C presenti nel primer, conteggiate direttamente e non espresse come percentuale. N è il numero totale di basi.

Per primer più corti di 14 nucleotidi, utilizza la regola di Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G e C indicano ciascuna il numero di occorrenze della rispettiva base nel primer.

Entrambe le formule presuppongono condizioni comuni di PCR: circa 50 nanomolari di primer e 50 millimolari di Na+.

Esempio di calcolo

Si consideri il primer di 19 basi ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. La sua lunghezza è 19, che è pari o superiore a 14, quindi il calcolatore utilizza la formula di Marmur-Doty.

• Lunghezza (N) = 19
• Conteggio G = 5, conteggio C = 5, quindi N_GC = 10 e il contenuto in GC è 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

La formula utilizza il conteggio delle basi GC, 10, non la percentuale di GC, 52,6. Utilizzando per errore la percentuale si ottiene una Tm vicina a 143 °C, un valore non realistico per una reazione di PCR eseguita tra 50 °C e 95 °C.

Come usare questo calcolatore

Digitare o incollare una sequenza di primer utilizzando solo le lettere A, T, G e C. Il calcolatore mostra la lunghezza della sequenza in nucleotidi (nt), il contenuto in GC espresso come percentuale e la temperatura di annealing calcolata in gradi Celsius. Il risultato può essere copiato negli appunti di laboratorio o in un protocollo.

Scelta della temperatura di appaiamento per la PCR

La Tm è una stima calcolata, non una temperatura di lavoro garantita. Molti protocolli iniziano la fase di annealing effettiva alcuni gradi al di sotto della Tm calcolata, quindi modificano la temperatura in base al risultato osservato su un gel. Per una coppia di primer, come punto di partenza si utilizza normalmente il valore di Tm più basso dei due primer. Una PCR a gradiente, che esegue contemporaneamente diverse reazioni in un intervallo di temperature, è un metodo comune per trovare la temperatura migliore mediante prove.

Altri modi per stimare la Tm

Le formule di Marmur-Doty e di Wallace utilizzate qui sono approssimazioni rapide basate soltanto sulla composizione delle basi. Esistono anche altri metodi:

• La termodinamica dei vicini più prossimi tiene conto dell'effetto di ogni coppia di basi adiacenti sulla stabilità ed è considerata il metodo più accurato per i primer standard.
• Le formule con correzione per la salinità aggiungono una correzione in base alla concentrazione degli ioni Na+ o K+ nel tampone di reazione, poiché una maggiore concentrazione di sale stabilizza la doppia elica del DNA e aumenta la Tm.

Calcolatori diversi possono riportare valori di Tm diversi per lo stesso primer perché utilizzano formule differenti. L'esecuzione della PCR e la verifica del risultato restano il test definitivo.

Domande frequenti

Che cos'è la temperatura di annealing del DNA?

È la temperatura alla quale i primer di DNA si legano alla sequenza complementare sul filamento stampo durante la PCR. Nei laboratori, di solito si imposta alcuni gradi al di sotto della temperatura di fusione (Tm) calcolata per il primer.

Come si calcola la Tm di un primer?

Per primer di 14 basi o più lunghi, Tm = 64,9 + 41 × (conteggio GC − 16,4) / lunghezza. Per primer più corti di 14 basi, Tm = 2 × (conteggio A+T) + 4 × (conteggio G+C).

Perché il contenuto in GC aumenta la Tm?

Le coppie di basi G-C formano tre legami a idrogeno, rispetto ai due delle coppie A-T. Un primer con una maggiore proporzione di basi G e C richiede più energia e quindi una temperatura più elevata per separarsi dal bersaglio.

La temperatura di appaiamento della PCR deve essere uguale alla Tm calcolata?

No. La maggior parte dei protocolli inizia alcuni gradi al di sotto della Tm calcolata e procede con aggiustamenti, perché la Tm indica il punto in cui solo metà del primer è legata.

La lunghezza del primer modifica la Tm?

Sì, anche se non in modo semplice. La lunghezza compare al denominatore della formula di Marmur-Doty, quindi un primer più lungo con un contenuto in GC medio non ha automaticamente una Tm più elevata di un primer più corto e ricco di GC.

Perché i diversi calcolatori della Tm danno risultati discordanti?

Utilizzano formule diverse. La regola di Wallace, la formula del contenuto in GC di Marmur-Doty, la termodinamica dei vicini più prossimi e le formule corrette per la concentrazione salina possono dare ciascuna una Tm diversa per lo stesso primer, talvolta con differenze di diversi gradi.

Riferimenti

1. Marmur J, Doty P. Determinazione della composizione in basi dell'acido desossiribonucleico dalla sua temperatura di denaturazione termica. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Ibridazione di oligodesossiribonucleotidi sintetici con il DNA phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Una visione unificata della termodinamica dei polimeri, del DNA a manubrio e degli oligonucleotidi basata sui vicini più prossimi. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.