Apskaičiuokite PCR efektyvumą iš Ct verčių ir atskiedimo faktorių. Analizuokite standartinius kreives, nustatykite amplifikacijos efektyvumą ir patvirtinkite savo kiekybinius PCR eksperimentus.
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Vertė turi būti teigiama
Įveskite galiojančius duomenis, kad sugeneruotumėte diagramą
qPCR efektyvumas yra PCR reakcijos veikimo rodiklis. 100% efektyvumas reiškia, kad PCR produkto kiekis dvigubėja su kiekvienu ciklu eksponentinėje fazėje.
Efektyvumas apskaičiuojamas iš standartinės kreivės nuolydžio, kuris gautas pavaizduojant Ct vertes prieš pradinio šablono koncentracijos logaritmą (skiedimo serija).
Efektyvumas (E) apskaičiuojamas naudojant formulę:
E = 10^(-1/slope) - 1
Kiekybinė polimerazės grandininė reakcija (qPCR) efektyvumas yra kritinis parametras, kuris tiesiogiai veikia jūsų qPCR eksperimentų tikslumą ir patikimumą. qPCR efektyvumo skaičiuoklė padeda tyrėjams nustatyti, kaip efektyviai jų PCR reakcijos amplifikuoja tikslias DNR sekas kiekviename terminiame cikle. Idealiuose qPCR reakcijose efektyvumas turėtų būti tarp 90-110%, nurodant, kad PCR produkto kiekis maždaug padvigubėja su kiekvienu ciklu eksponentinėje fazėje.
Prasta amplifikacijos efektyvumas gali sukelti netikslią kiekybę, nepatikimus rezultatus ir klaidingas eksperimentines išvadas. Apskaičiuodami ir stebėdami savo qPCR efektyvumą, galite optimizuoti reakcijos sąlygas, patvirtinti primerių dizainą ir užtikrinti savo kiekybinio PCR duomenų kokybę.
Ši skaičiuoklė naudoja standartinio kreivės metodą, kuris braižo ciklo slenkstį (Ct) vertes prieš logaritmą šablono koncentracijos (atstovaujamos serijinėmis skiedimo), kad nustatytų jūsų qPCR analizės efektyvumą. Gautas šios standartinės kreivės nuolydis vėliau naudojamas efektyvumui apskaičiuoti naudojant paprastą matematinę formulę.
qPCR reakcijos efektyvumas apskaičiuojamas iš standartinės kreivės nuolydžio naudojant šią formulę:
Kur:
Idealiai PCR reakcijai su 100% efektyvumu (puikus amplikonų padvigubėjimas su kiekvienu ciklu) nuolydis būtų -3.32. Tai yra todėl, kad:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (arba 100%)}
Efektyvumo procentas apskaičiuojamas padauginus dešimtainį efektyvumą iš 100:
\text{Efektyvumas (%)} = E \times 100\%
Standartinė kreivė sukurta braižant Ct vertes (y ašis) prieš logaritmą pradinės šablono koncentracijos arba skiedimo faktoriaus (x ašis). Šių kintamųjų santykis turėtų būti linijinis, o šios linijinės santykio kokybė vertinama naudojant determinacijos koeficientą (R²).
Patikimiems qPCR efektyvumo skaičiavimams:
Duomenų paruošimas: Skaičiuoklė priima jūsų Ct vertes kiekvienam skiedimo taškui ir skiedimo faktoriui kaip įvestis.
Logaritminis transformavimas: Skiedimo serija transformuojama į logaritminę skalę (logaritmas dešimtine).
Linijinė regresija: Skaičiuoklė atlieka linijinės regresijos analizę logaritmų transformuotiems duomenims, kad nustatytų nuolydį, y-interceptą ir R² vertę.
Efektyvumo skaičiavimas: Naudojant nuolydžio vertę, efektyvumas apskaičiuojamas naudojant formulę E = 10^(-1/slope) - 1.
Rezultatų interpretacija: Skaičiuoklė automatiškai rodo efektyvumą procentais, kartu su nuolydžiu ir R² verte, kad padėtų jums įvertinti savo qPCR analizės patikimumą.
Sekite šiuos žingsnius, kad apskaičiuotumėte savo qPCR efektyvumą:
Nustatykite skiedimų skaičių: Pasirinkite, kiek skiedimo taškų turite savo standartinėje kreivėje (rekomenduojama nuo 3 iki 7 taškų).
Įveskite skiedimo faktorių: Įveskite skiedimo faktorių, naudojamą tarp nuoseklių mėginių (pvz., 10, jei tai 10 kartų skiedimo serija, 5, jei tai 5 kartų skiedimo serija).
Įveskite Ct vertes: Įveskite Ct vertes kiekvienam skiedimo taškui. Paprastai pirmasis skiedimas (Skiedimas 1) turi didžiausią šablono koncentraciją, todėl gaunama mažiausia Ct vertė.
Peržiūrėkite rezultatus: Skaičiuoklė automatiškai apskaičiuos ir parodys:
Interpretacija: Įvertinkite, ar jūsų qPCR efektyvumas patenka į priimtiną diapazoną (90-110%) ir ar R² vertė rodo patikimą standartinę kreivę (≥ 0.98).
Kopijuoti rezultatus: Naudokite mygtuką „Kopijuoti rezultatus“, kad nukopijuotumėte visus apskaičiuotus duomenis savo įrašams ar publikacijoms.
Pažvelkime į pavyzdį:
Kai braižoma standartinėje kreivėje:
Skaičiuoklė atliks linijinę regresiją ir nustatys:
Naudojant efektyvumo formulę:
Tai rodo gerą qPCR efektyvumą, esantį 93%, kuris patenka į priimtiną 90-110% diapazoną.
Prieš naudojant naują primerių porą kiekybiniams eksperimentams, būtina patvirtinti jos veikimą. qPCR efektyvumo skaičiavimas padeda:
Kuriant naujas qPCR analizės, efektyvumo skaičiavimai yra esminiai:
Santykinio kiekybinių eksperimentų metu, žinant PCR efektyvumą, yra esminis:
Klinikinėse ir diagnostinėse aplinkose qPCR efektyvumas yra svarbus:
Aplinkos ir maisto saugos taikymuose efektyvumo skaičiavimai padeda:
Nors standartinio kreivės metodas yra dažniausiai naudojamas qPCR efektyvumo skaičiavimui, yra alternatyvūs metodai:
Šis metodas apskaičiuoja efektyvumą iš fluorescencijos duomenų vieno amplifikacijos kreivės, nereikalaujant skiedimo serijos. Programinė įranga, tokia kaip LinRegPCR, analizuoja individualių reakcijų eksponentinę fazę, kad nustatytų efektyvumą.
Privalumai:
Trūkumai:
Skaitmeninė PCR (dPCR) suteikia absoliučią kiekybę, nereikalaujant standartinės kreivės ar efektyvumo skaičiavimų.
Privalumai:
Trūkumai:
Kai kuri programinė įranga qPCR analizei siūlo palyginamojo kiekybinių metodus, kurie įvertina efektyvumą be pilnos standartinės kreivės.
Privalumai:
Trūkumai:
qPCR ir efektyvumo skaičiavimų plėtra per pastaruosius kelis dešimtmečius žymiai pasikeitė:
Polimerazės grandininė reakcija (PCR) buvo išrasta Kary Mullis 1983 m., revoliucionavusi molekulinę biologiją. Tačiau tradicinė PCR buvo tik kokybinė arba pusiau kiekybinė. Pirmasis realaus laiko PCR sistema buvo sukurta 1990-aisiais Russell Higuchi ir jo kolegų, kurie parodė, kad stebint PCR produktus, kai jie kaupiasi (naudojant etidžio bromido fluorescenciją), galima gauti kiekybinę informaciją.
Kai qPCR technologija tobulėjo, tyrėjai pripažino standartizacijos ir validacijos svarbą. PCR efektyvumo koncepcija tapo centrine patikimos kiekybės užtikrinimo dalimi:
Sritis ir toliau vystėsi su:
Šiandien qPCR efektyvumo skaičiavimas ir ataskaitos laikomas esminiu, norint paskelbti patikimus qPCR duomenis, o tokios priemonės kaip ši skaičiuoklė padeda tyrėjams laikytis geriausių praktikos standartų šioje srityje.
1' Excel formulė qPCR efektyvumui apskaičiuoti iš nuolydžio
2' Įdėkite į langelį B2, jei nuolydis yra langelyje A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formulė efektyvumui procentais konvertuoti
6' Įdėkite į langelį C2, jei efektyvumo dešimtainis yra langelyje B2
7=B2*100
8
9' Funkcija efektyvumui apskaičiuoti iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Apskaičiuoti linijinę regresiją
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Apskaičiuoti nuolydį
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Apskaičiuoti efektyvumą
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R funkcija qPCR efektyvumui apskaičiuoti iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Sukurti log skiedimo vertes
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Atlikti linijinę regresiją
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Išgauti nuolydį ir R-kvadrato vertę
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Apskaičiuoti efektyvumą
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Grąžinti rezultatus
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Pavyzdžio naudojimas
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektyvumas: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Nuolydis: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadratas: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Apskaičiuoti qPCR efektyvumą iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus.
8
9 Parametrai:
10 ct_values (list): Ct vertių sąrašas
11 dilution_factor (float): Skiedimo faktorius tarp nuoseklių mėginių
12
13 Grąžina:
14 dict: Žodynas, kuriame yra efektyvumas, nuolydis, r_squared ir intercept
15 """
16 # Sukurti log skiedimo vertes
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Atlikti linijinę regresiją
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Apskaičiuoti efektyvumą
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Braižyti standartinę kreivę su regresijos linija.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generuoti taškus regresijos linijai
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Skiedimas')
48 plt.ylabel('Ct Vertė')
49 plt.title('qPCR Standartinė Kreivė')
50
51 # Pridėti lygtį ir R² į diagramą
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efektyvumas = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Pavyzdžio naudojimas
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektyvumas: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Nuolydis: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadratas: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Braižyti standartinę kreivę
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Apskaičiuoti qPCR efektyvumą iš Ct vertių ir skiedimo faktoriaus
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct vertių masyvas
4 * @param {number} dilutionFactor - Skiedimo faktorius tarp nuoseklių mėginių
5 * @returns {Object} Objektas, kuriame yra efektyvumas, nuolydis, rSquared ir intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Sukurti log skiedimo vertes
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Apskaičiuoti vidurkius linijinei regresijai
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Apskaičiuoti nuolydį ir interceptą
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Apskaičiuoti R-kvadrato vertę
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Apskaičiuoti efektyvumą
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Pavyzdžio naudojimas
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektyvumas: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Nuolydis: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadratas: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Geras qPCR efektyvumas paprastai yra tarp 90% ir 110% (0.9-1.1). 100% efektyvumas reiškia puikų amplifikacijos padvigubėjimą su kiekvienu ciklu. Efektyvumas už šio diapazono gali rodyti problemas su primerių dizainu, reakcijos sąlygomis arba inhibitoriais.
Efektyvumas, didesnis nei 100%, gali pasireikšti dėl:
Maža R² vertė (žemiau 0.98) rodo prastą linijiškumą jūsų standartinėje kreivėje, kuri gali būti sukelta:
Patikimiems efektyvumo skaičiavimams reikia bent 3 skiedimo taškų, tačiau rekomenduojama 5-6 taškai, kad būtų gauti tikslesni rezultatai. Šie taškai turėtų apimti visą dinaminį diapazoną, tikėtiną jūsų eksperimentiniuose mėginiuose.
Santykiniuose kiekybiniuose eksperimentuose naudojant ΔΔCt metodą, laikoma, kad tikslinių ir referencinių genų efektyvumas yra vienodas (idealiai 100%). Kai efektyvumas reikšmingai skiriasi:
Ne, efektyvumas turėtų būti nustatomas kiekvienai primerių porai ir turėtų būti pakartotinai patvirtinamas:
PCR inhibitoriai gali:
Šie terminai dažnai vartojami sinonimiškai, tačiau:
Norint pagerinti qPCR efektyvumą:
Palyginti mėginius su reikšmingai skirtingu efektyvumu nerekomenduojama, nes:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE gairės: minimalios informacijos publikavimui apie kiekybinius realaus laiko PCR eksperimentus. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Naujas matematinis modelis santykiniam kiekybiniam nustatymui realaus laiko RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kaip gerai yra PCR efektyvumo įvertinimas: rekomendacijos tiksliems ir patikimiems qPCR efektyvumo vertinimams. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Galutinis qPCR eksperimentas: publikacijos kokybiškų, reprodukuojamų duomenų gavimas pirmą kartą. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifikacijos efektyvumas: ryšys tarp bazinės linijos ir šališkumo kiekybinių PCR duomenų analizėje. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetinė PCR analizė: realaus laiko PCR amplifikacijos reakcijų stebėjimas. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Programų Gidas. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Vadovas. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Mūsų qPCR efektyvumo skaičiuoklė suteikia paprastą, tačiau galingą įrankį tyrėjams, kad patvirtintų ir optimizuotų savo kiekybinius PCR eksperimentus. Tiksliai apskaičiuodami efektyvumą iš standartinių kreivių, galite užtikrinti patikimą kiekybę, išspręsti problemas su problematiškomis analizėmis ir laikytis geriausių praktikos standartų qPCR eksperimentuose.
Išbandykite mūsų skaičiuoklę šiandien, kad pagerintumėte savo qPCR duomenų kokybę ir patikimumą!
Raskite daugiau įrankių, kurie gali būti naudingi jūsų darbo eiga.