DNR Koncentracijos Skaičiuoklė

DNR koncentracijos skaičiuoklė UV spinduliuotės absorbcijos rodmenį ties 260 nanometrų bangos ilgiu, vadinamą A260, perskaičiuoja į DNR koncentraciją nanogramais mikrolitre (ng/µL). Ji taip pat pateikia bendrą DNR kiekį mėginyje mikrogramais (µg).

Kas yra A260 absorbcija?

A260 – tai ultravioletinės šviesos kiekis, kurį tirpalas sugeria esant 260 nanometrų bangos ilgiui. DNR stipriausiai sugeria UV šviesą ties šiuo bangos ilgiu dėl savo nukleotidų bazių. Spektrofotometras, atlikus tuščiojo mėginio rodmens nustatymą, išmatuoja A260; foninei absorbcijai pašalinti naudojamas toks pats buferis kaip ir mėginyje. Kuo daugiau DNR yra tirpale, tuo didesnis A260 rodmuo.

DNR koncentracijos formulė

Dvigrandė DNR UV šviesą sugeria proporcingai jos koncentracijai; šis ryšys vadinamas Beerio ir Lamberto dėsniu. Naudojant standartinį 1 centimetro šviesos kelią, tirpale, kurio A260 rodmuo yra 1,0, yra maždaug 50 ng/µL dvigrandės DNR. Šis skaičius, perskaičiavimo koeficientas, bet kokį A260 rodmenį paverčia koncentracija:

DNR koncentracija (ng/µL) = A260 × 50 × praskiedimo koeficientas

Praskiedimo koeficientas atsižvelgia į bet kokį praskiedimą, atliktą prieš išmatuojant mėginį. Nepraskiestam mėginiui taikomas 1 praskiedimo koeficientas.

Kaip apskaičiuoti bendrą DNR kiekį

Žinant koncentraciją, bendrą DNR masę mėginyje galima rasti pagal jo tūrį:

Bendras DNR kiekis (µg) = koncentracija (ng/µL) × tūris (µL) ÷ 1000

Kaip apskaičiuoti DNR koncentraciją: žingsnis po žingsnio

Prieš matuodami gerai sumaišykite mėginį. DNR gali prilipti prie mėgintuvėlio sienelių arba netolygiai nusėsti.
Jei mėginys yra labai koncentruotas, jį praskieskite ir siekite, kad A260 rodmuo būtų nuo 0,1 iki 1,0. Už šio intervalo ribų spektrofotometro rodmenys yra mažiausiai patikimi.
Spektrofotometrą nustatykite pagal tuščiąjį mėginį, naudodami tą patį buferį, kuris buvo naudojamas praskiedimui, tada išmatuokite mėginį ties 260 nm.
Į skaičiuoklę įveskite A260 rodmenį, mėginio tūrį ir praskiedimo koeficientą, kad gautumėte koncentraciją ir bendrą DNR kiekį. Kad būtų pateiktas rezultatas, turi būti užpildyti visi trys laukai, o tūris turi būti didesnis už nulį.

Skaičiavimo pavyzdys

Pavyzdys 1: nepraskiestas mėginys

A260 rodmuo yra 0,5, mėginys nepraskiestas (praskiedimo koeficientas 1), o mėginio tūris yra 100 µL.

Koncentracija = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Bendras DNR kiekis = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Pavyzdys 2: praskiestas mėginys

Mėgintuvėlyje yra 50 µL išgrynintos DNR. Nedidelė jos dalis buvo praskiesta 10 kartų, o praskiestoje dalyje gautas A260 rodmuo buvo 0,75. Praskiedimo koeficientas perskaičiuoja šį rodmenį į koncentraciją pradiniame mėgintuvėlyje, o 50 µL yra tūris, įvedamas atliekant bendro DNR kiekio skaičiavimą.

Koncentracija = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Bendras DNR kiekis = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Praskiedimo koeficiento apskaičiavimas

Praskiedimo koeficientas = bendras tūris po praskiedimo ÷ pradinio mėginio tūris.

Įpylus 5 µL DNR tirpalo į 45 µL buferio, bendras tūris yra 50 µL, todėl praskiedimo koeficientas yra 50 ÷ 5 = 10. Nepraskiesto mėginio praskiedimo koeficientas yra 1.

Įprasti DNR koncentracijos intervalai

Koncentracija priklauso nuo mėginio tipo ir ekstrakcijos metodo. Genominės DNR išskyrimo mėginių koncentracija dažniausiai būna maždaug nuo 10 iki 100 ng/µL. Plazmidinės DNR preparatų koncentracija dažnai būna didesnė, kartais siekia kelis šimtus ng/µL. Rezultatas, gerokai nukrypstantis nuo konkrečiam metodui tikėtino intervalo, gali rodyti išskyrimo proceso arba paties matavimo problemą.

UV absorbcijos matavimo ribos

A260 matuojamas greitai, tačiau tai nėra jautriausias ar specifiškiausias DNR nustatymo metodas. Baltymai, RNR ir kai kurie buferio komponentai taip pat sugeria šviesą ties 260 nm, todėl gali padidinti rodmenį. Siekiant patikrinti, ar nėra baltymų taršos, kartu su koncentracija dažnai vertinamas A260/A280 santykis; santykis, artimas 1,8, paprastai rodo grynos DNR mėginį. Fluorescenciniais dažais pagrįsti metodai, pavyzdžiui, Qubit tyrimai, jungiasi tik prie dvigrandės DNR ir leidžia tiksliau išmatuoti praskiestų arba užterštų mėginių koncentraciją, tačiau jiems reikia papildomų reagentų ir fluorometro.

Dažnai užduodami klausimai

Kaip apskaičiuoti DNR koncentraciją pagal A260?

A260 rodmenį padauginkite iš 50, standartinio dvigrandės DNR perskaičiavimo koeficiento, tada padauginkite iš praskiedimo koeficiento. Jei mėginys nebuvo praskiestas, naudokite 1 praskiedimo koeficientą.

Koks yra geras A260/A280 santykis?

Santykis, artimas 1,8, paprastai rodo grynos DNR mėginį. Mažesnis santykis rodo baltymų taršą. Didesnis nei 2,0 santykis gali rodyti RNR taršą.

Ar šią skaičiuoklę galima naudoti RNR?

Ne tiesiogiai, nes RNR taikomas 40 ng/µL perskaičiavimo koeficientas, o ne 50. Norėdami įvertinti RNR koncentraciją, skaičiuoklės rezultatą padauginkite iš 0,8 (40 ÷ 50) arba tiesiogiai naudokite A260 × 40 × praskiedimo koeficientą.

Kodėl A260 rodmuo turėtų būti nuo 0,1 iki 1,0?

Kaip aprašyta Beerio ir Lamberto dėsnyje, daugiausia šiame intervale absorbcija išlieka maždaug proporcinga koncentracijai. Už jo ribų rodmenys tampa mažiau patikimi, todėl per daug koncentruotą arba per daug praskiestą mėginį prieš pakartotinį matavimą reikia praskiesti arba sukoncentruoti.

Kuo skiriasi koncentracija ir grynumas?

Koncentracija rodo, kiek DNR yra mėginyje, ng/µL. Grynumas rodo, kiek mėginys yra švarus; jis daugiausia vertinamas pagal absorbcijos santykius, pavyzdžiui, A260/A280. Mėginio koncentracija gali būti didelė, tačiau jis vis tiek gali būti negrynas, arba koncentracija gali būti maža, o mėginys – labai grynas.

Kaip perskaičiuoti ng/µL į µg/mL?

Šie du vienetai skaitine prasme yra lygūs. 1 ng/µL lygu 1 µg/mL, nes masės ir tūrio vienetai keičiasi po 1000 kartų.

Šaltiniai

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-iasis leidimas). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). DNR ir RNR kiekybinis nustatymas absorbcinės ir fluorescencinės spektroskopijos metodais. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). A260/A280 santykių reikšmė vertinant nukleorūgščių grynumą. BioTechniques, 19(2), 208–210.

DNR Koncentracijos Skaičiuoklė | A260 į ng/μL Keitiklis