DNR Ligationo Skaičiuoklė

Įvadas

DNR ligacija yra svarbi molekulinės biologijos technika, naudojama DNR fragmentams sujungti kovalentiniais ryšiais. DNR Ligationo Skaičiuoklė yra esminis įrankis tyrėjams, padedantis nustatyti optimalų vektoriaus ir įterpimo DNR kiekius, reikalingus sėkmingoms ligacijos reakcijoms. Apskaičiuodama teisingus molinius santykius tarp vektoriaus (plazmidės) ir įterpimo DNR fragmentų, ši skaičiuoklė užtikrina efektyvias molekulinės klonavimo eksperimentus, tuo pačiu sumažindama švaistomų reagentų ir nesėkmingų reakcijų kiekį.

Ligationo reakcijos yra pagrindinės genetinės inžinerijos, sintetinių biologijų ir molekulinio klonavimo procedūrų. Jos leidžia mokslininkams kurti rekombinantines DNR molekules, įterpiant dominančius genus į plazmidžių vektorius, kad vėliau būtų transformuoti į šeimininkų organizmus. Šių reakcijų sėkmė labai priklauso nuo tinkamų DNR komponentų kiekių, ką tiksliai padeda nustatyti ši skaičiuoklė.

Ar jūs kuriate ekspresijos vektorius, kuriate genų bibliotekas ar atliekate kasdienį subklonavimą, ši DNR ligacijos skaičiuoklė padės jums optimizuoti eksperimentines sąlygas ir padidinti sėkmės rodiklį. Įvesdami keletą pagrindinių parametrų apie jūsų DNR mėginius, galite greitai gauti tikslius tūrius, reikalingus jūsų konkrečiai ligacijos reakcijai.

Formulė/Skaičiavimas

DNR ligacijos skaičiuoklė naudoja pagrindinę molekulinės biologijos formulę, kuri atsižvelgia į skirtingus DNR fragmentų dydžius ir koncentracijas, kurie yra sujungiami. Pagrindinis skaičiavimas nustato, kiek įterpimo DNR reikia, palyginti su vektoriaus DNR, remiantis jų atitinkamais ilgiais ir pageidaujamu moliniu santykiu.

Įterpimo Kiekio Apskaičiavimas

Reikalingas įterpimo DNR kiekis (nanogramais) apskaičiuojamas naudojant šią formulę:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

Kur:

ng of vector = naudojamo vektoriaus DNR kiekis reakcijoje (paprastai 50-100 ng)
kb size of insert = įterpimo DNR fragmento ilgis kilobazėmis (kb)
kb size of vector = vektoriaus DNR ilgis kilobazėmis (kb)
molar ratio = pageidaujamas įterpimo molekulių ir vektoriaus molekulių santykis (paprastai 3:1 iki 5:1)

Tūrio Apskaičiavimai

Kai nustatomas reikalingas įterpimo DNR kiekis, apskaičiuojami reakcijai reikalingi tūriai:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Pavyzdžio Apskaičiavimas

Pažiūrėkime praktišką pavyzdį:

Vektoriaus koncentracija: 50 ng/μL
Vektoriaus ilgis: 3000 bp (3 kb)
Įterpimo koncentracija: 25 ng/μL
Įterpimo ilgis: 1000 bp (1 kb)
Pageidaujamas molinis santykis (įterpimas:vektorius): 3:1
Bendras reakcijos tūris: 20 μL
Naudojamo vektoriaus kiekis: 50 ng

1 žingsnis: Apskaičiuokite reikalingą įterpimo kiekį $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

2 žingsnis: Apskaičiuokite tūrius $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Šis skaičiavimas užtikrina, kad reakcijoje būtų trys įterpimo molekulės už kiekvieną vektoriaus molekulę, optimizuojant sėkmingos ligacijos galimybes.

Žingsnis po Žingsnio Gidas, Kaip Naudoti Skaičiuoklę

Mūsų DNR Ligationo Skaičiuoklė yra sukurta taip, kad būtų intuityvi ir paprasta. Sekite šiuos žingsnius, kad apskaičiuotumėte optimalų tūrius savo ligacijos reakcijai:

Įveskite Vektoriaus Informaciją:
- Įveskite vektoriaus koncentraciją ng/μL
- Įveskite vektoriaus ilgį bazinėmis poromis (bp)
- Nurodykite, kiek vektoriaus DNR norite naudoti reakcijoje (ng)
Įveskite Įterpimo Informaciją:
- Įveskite įterpimo koncentraciją ng/μL
- Įveskite įterpimo ilgį bazinėmis poromis (bp)
Nustatykite Reakcijos Parametrus:
- Nurodykite pageidaujamą molinį santykį (įterpimas:vektorius) - paprastai tarp 3:1 ir 5:1
- Įveskite bendrą reakcijos tūrį μL (paprastai 10-20 μL)
Peržiūrėkite Rezultatus:
- Skaičiuoklė automatiškai parodys:
  - Reikalingą vektoriaus tūrį (μL)
  - Reikalingą įterpimo tūrį (μL)
  - Pridėti buferio/vandens tūrį (μL)
  - Bendrą reakcijos tūrį (μL)
  - Vektoriaus ir įterpimo DNR kiekį reakcijoje (ng)
Kopijuoti Rezultatus (pasirinktinai):
- Naudokite „Kopijuoti rezultatus“ mygtuką, kad nukopijuotumėte visus skaičiavimus į savo iškarpinę, kad galėtumėte naudoti savo laboratorijos užrašų knygoje ar protokoluose

Skaičiuoklė atlieka validacijos patikrinimus, kad užtikrintų, jog visi įvedimai yra teigiami skaičiai ir kad bendras tūris yra pakankamas reikiamiems DNR tūriams. Jei bus aptikta kokių nors klaidų, naudingos klaidų žinutės padės jums ištaisyti įvedimus.

Naudojimo Atvejai

DNR Ligationo Skaičiuoklė yra vertinga daugelyje molekulinės biologijos taikymų:

Molekulinis Klonavimas

Dažniausias naudojimo atvejis yra standartinis molekulinis klonavimas, kur mokslininkai įterpia genus ar DNR fragmentus į plazmidžių vektorius. Skaičiuoklė užtikrina optimalias sąlygas:

Subklonavimui genų tarp skirtingų ekspresijos vektorių
Sukuriant sujungtus baltymus, sujungiant kelis genų fragmentus
Kuriant reporterio geno bandymus
Statant plazmidžių bibliotekas

Sintetinė Biologija

Sintetinėje biologijoje, kur dažnai sujungiami keli DNR fragmentai:

Gibsono Asamblėja reaguoja iš tikslinių įterpimo:vektoriaus santykių
Golden Gate asamblėjos sistemos reikalauja specifinių DNR koncentracijų
BioBrick standartizuotų genetinių dalių asamblėja
Sintetinių genetinių grandinių statyba

Diagnostikos Rinkiniai

Kuriant molekulinius diagnostikos įrankius:

Ligavimas ligos specifinių genetinių žymenų
Teigiamų kontrolinių plazmidžių statyba
Kalibravimo standartų kūrimas qPCR

Baltymo Ekspresijos Sistemos

Tyrėjams, dirbantiems su baltymų gamyba:

Optimizuojant įterpimo:vektoriaus santykius aukšto kopijavimo ekspresijos vektoriuose
Sukuriant indukuojamas ekspresijos sistemas
Kuriant sekrecijos vektorius baltymų valymui

CRISPR-Cas9 Taikymas

Genomo redagavimo taikymuose:

Kuriant gido RNR plazmidžių vektoriuose
Sukuriant donorinius šablonus homologiškai nukreiptam remontui
Kuriant gido RNR bibliotekas filtravimui

Iššūkių Ligationai

Skaičiuoklė ypač vertinga sudėtingose ligacijos situacijose:

Didelių įterpimų klonavimas (>5 kb)
Labai mažų fragmentų įterpimas (<100 bp)
Tiesių galų ligacijos, kurios turi mažesnį efektyvumą
Daugifrakčių asamblėjos reakcijos

Alternatyvos

Nors mūsų DNR Ligationo Skaičiuoklė teikia tikslius skaičiavimus tradicinėms ligacijos reakcijoms, egzistuoja keletas alternatyvių metodų DNR fragmentams sujungti:

Gibsono Asamblėja: Naudoja eksonukleazę, polimerazę ir ligazę viename mėginyje, kad sujungtų persidengiančius DNR fragmentus. Nereikia tradicinio ligacijos skaičiavimo, tačiau koncentracijos santykiai vis tiek yra svarbūs.
Golden Gate Asamblėja: Naudoja Tipo IIS restrikcijos fermentus, kad sujungtų kelis fragmentus kryptingai ir be randų. Reikia ekvivalentinių visų fragmentų kiekių.
SLIC (Sekos ir Ligacijos Nepriklausomas Klonavimas): Naudoja eksonukleazę, kad sukurtų viengubus viršūnių, kurios sujungs. Paprastai naudojami ekvivalentiniai fragmentų santykiai.
In-Fusion Klonavimas: Komercinė sistema, leidžianti sujungti fragmentus su 15 bp persidengimais. Naudoja specifinį santykį, pagrįstą fragmentų dydžiais.
Gateway Klonavimas: Naudoja specifinį rekombinavimą vietoje ligacijos. Reikalauja specifinių įėjimo ir paskirties vektorių.
Empiriniai Bandymai: Kai kurie laboratorijos teikia pirmenybę nustatyti kelias ligacijos reakcijas su skirtingais įterpimo:vektoriaus santykiais (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) ir nustatyti, kuris veikia geriausiai jų specifiniams konstruktams.
Programinės Įrangos Skaičiuoklės: Komercinės programinės įrangos paketai, tokie kaip Vector NTI ir SnapGene, apima ligacijos skaičiuokles su papildomomis funkcijomis, tokiomis kaip restrikcijos vietų analizė.

Istorija

DNR ligacijos skaičiavimų plėtra atitinka molekulinio klonavimo technikų evoliuciją, kuri pakeitė molekulinę biologiją ir biotechnologijas.

Ankstyvieji Vystymosi Etapai (1970-ieji)

DNR ligacijos koncepcija molekuliniam klonavimui atsirado 1970-ųjų pradžioje, kai Paul Berg, Herbert Boyer ir Stanley Cohen sukūrė pirmuosius rekombinantinius DNR molekules. Šiuo laikotarpiu ligacijos reakcijos buvo daugiausia empirinės, mokslininkams naudojant bandymų ir klaidų metodą, kad nustatytų optimalias sąlygas.

Restrikcijos fermentų ir DNR ligazės atradimas suteikė būtinus įrankius DNR molekulėms pjauti ir vėl sujungti. T4 DNR ligazė, izoliuota iš T4 bakteriofago užkrėsto E. coli, tapo standartiniu fermentu DNR fragmentams sujungti dėl savo gebėjimo sujungti tiek tiesius, tiek kohezinius galus.

Tobulinimo Periodas (1980-1990)

Kai molekulinis klonavimas tapo įprastas, mokslininkai pradėjo plėtoti sistemingesnius požiūrius į ligacijos reakcijas. Tapus akivaizdu, kad moliniai santykiai tarp vektoriaus ir įterpimo DNR yra svarbūs, buvo sukurta pagrindinė formulė, kuri vis dar naudojama šiandien.

Šiuo laikotarpiu mokslininkai nustatė, kad perteklinė įterpimo DNR (paprastai 3:1 iki 5:1 molinis santykis) paprastai pagerina ligacijos efektyvumą standartinėms klonavimo programoms. Ši žinia iš pradžių buvo dalijamasi laboratorijų protokoluose ir palaipsniui pateko į molekulinės biologijos vadovus ir mokymo knygas.

Moderni Era (2000-Šiandien)

Kompiuterinių įrankių ir internetinių skaičiuoklių atsiradimas 2000-aisiais padarė tikslius ligacijos skaičiavimus prieinamesnius tyrėjams. Kai molekulinės biologijos technikos tapo sudėtingesnės, poreikis tiksliems skaičiavimams tapo kritiškai svarbus, ypač sudėtingiems klonavimo projektams, susijusiems su keliais fragmentais ar dideliais įterpimais.

Šiandien DNR ligacijos skaičiavimai yra neatskiriama molekulinio klonavimo darbo proceso dalis, o tokios specializuotos skaičiuoklės kaip ši padeda mokslininkams optimizuoti savo eksperimentus. Pagrindinė formulė iš esmės liko nepakitusi, nors mūsų supratimas apie veiksnius, turinčius įtakos ligacijos efektyvumui, pagerėjo.

Alternatyvių klonavimo metodų, tokių kaip Gibsono Asamblėja ir Golden Gate klonavimas, atsiradimas įvedė naujas skaičiavimo poreikius, tačiau pagrindinė koncepcija apie molinius santykius tarp DNR fragmentų išlieka svarbi visose šiose technikose.

Kodo Pavyzdžiai

Štai DNR ligacijos skaičiuoklės įgyvendinimai įvairiose programavimo kalbose:

1' Excel VBA Funkcija DNR Ligationo Skaičiuoklei
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Apskaičiuoti reikalingą įterpimo kiekį ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Apskaičiuoti vektoriaus tūrį μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Apskaičiuoti įterpimo tūrį μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Apskaičiuoti buferio/vandens tūrį μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Naudojimo pavyzdys ląstelėje:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Apskaičiuoti tūrius DNR ligacijos reakcijai.
5    
6    Parametrai:
7    vector_concentration (float): Vektoriaus DNR koncentracija ng/μL
8    vector_length (float): Vektoriaus DNR ilgis bazinėmis poromis
9    insert_concentration (float): Įterpimo DNR koncentracija ng/μL
10    insert_length (float): Įterpimo DNR ilgis bazinėmis poromis
11    molar_ratio (float): Pageidaujamas įterpimo:vektoriaus santykis
12    total_volume (float): Bendras reakcijos tūris μL
13    vector_amount (float): Naudojamo vektoriaus DNR kiekis ng (numatytas: 50)
14    
15    Grąžina:
16    dict: Žodynas, kuriame yra apskaičiuoti tūriai ir kiekiai
17    """
18    # Apskaičiuoti vektoriaus tūrį
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Apskaičiuoti reikalingą įterpimo kiekį
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Apskaičiuoti įterpimo tūrį
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Apskaičiuoti buferio/vandens tūrį
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Pavyzdžio naudojimas
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektorius: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Įterpimas: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buferis: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Bendras: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Paversti ilgius į kb skaičiavimui
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Apskaičiuoti reikalingą įterpimo kiekį
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Apskaičiuoti tūrius
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Pavyzdžio naudojimas
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektorius: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Įterpimas: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buferis: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Bendras: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Paversti ilgius į kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Apskaičiuoti reikalingą įterpimo kiekį
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Apskaičiuoti tūrius
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Suapvalinti iki 2 dešimtainių
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektorius: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Įterpimas: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buferis: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Bendras: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Paversti ilgius į kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Apskaičiuoti reikalingą įterpimo kiekį
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Apskaičiuoti tūrius
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Suapvalinti iki 2 dešimtainių
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektorius: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Įterpimas: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buferis: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Bendras: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Dažnai Užduodami Klausimai (DUK)

Koks yra optimalus molinis santykis DNR ligacijai?

Optimalus įterpimo ir vektoriaus molinis santykis paprastai svyruoja nuo 3:1 iki 5:1 standartinėms klonavimo programoms. Tačiau tai gali skirtis priklausomai nuo konkrečios ligacijos situacijos:

Tiesių galų ligacijoms: 3:1 iki 5:1
Klampių galų ligacijoms: 1:1 iki 3:1
Dideliems įterpimams (>10 kb): 1:1 iki 2:1
Mažiems įterpimams (<500 bp): 5:1 iki 10:1
Daugifrakčių asamblėjoms: 3:1 kiekvienam įterpimui ir vektoriui

Kodėl mano ligacijos reakcija nepavyksta, nepaisant apskaičiuotų tūrių?

Kelios priežastys gali paveikti ligacijos efektyvumą, be molinio santykio:

DNR kokybė: Įsitikinkite, kad tiek vektorius, tiek įterpimas turi švarius galus be pažeidimų
Defozforilinimas: Patikrinkite, ar jūsų vektorius buvo defosforilintas, kas neleidžia savarankiškai liguotis
Fermento aktyvumas: Patikrinkite, ar jūsų ligazė yra aktyvi ir naudojama teisingoje temperatūroje
Inkubacijos laikas: Kai kurios ligacijos gali pasinaudoti ilgesniu inkubavimu (per naktį 16°C)
Buferio sąlygos: Įsitikinkite, kad naudojamas teisingas buferis su ATP
Teršalai: Išvalykite DNR, kad pašalintumėte inhibitorius, tokius kaip EDTA arba didelis druskos kiekis

Kiek vektoriaus DNR turėčiau naudoti ligacijos reakcijoje?

Paprastai rekomenduojama naudoti 50-100 ng vektoriaus DNR standartinėms ligacijos reakcijoms. Naudojant per daug vektoriaus gali padidėti fono lygis, nes nesukurtas ar savarankiškai liguotas vektorius, o per mažai gali sumažinti transformacijos efektyvumą. Sudėtingoms ligacijoms gali prireikti optimizuoti šį kiekį.

Ar turėčiau koreguoti skaičiavimus tiesių galų ir klampių galų ligacijoms?

Taip. Tiesių galų ligacijos paprastai yra mažiau efektyvios nei klampių galų (kohezinių galų) ligacijos. Tiesių galų ligacijoms naudokite:

Didesnius molinius santykius (3:1 iki 5:1 arba net didesnius)
Daugiau T4 DNR ligazės (paprastai 2-3 kartus daugiau)
Ilgesnius inkubacijos laikus
Apsvarstykite galimybę pridėti PEG, kad padidintumėte ligacijos efektyvumą

Kaip apskaičiuoti ligaciją keliems įterpimams?

Kelių fragmentų asamblėjai:

Apskaičiuokite kiekvieno įterpimo kiekį atskirai, naudodami tą pačią formulę
Išlaikykite tą patį bendrą molinį santykį (pvz., dviem įterpimams naudokite 1.5:1.5:1 įterpimas1:įterpimas2:vektorius)
Koreguokite bendrą reakcijos tūrį, kad apimtumėte visus DNR fragmentus
Apsvarstykite galimybę naudoti nuoseklią ligaciją arba naudoti asamblėjos metodus, tokius kaip Gibsono Asamblėja, keliems fragmentams

Ar galiu naudoti šią skaičiuoklę Gibsono Asamblėjai ar Golden Gate Asamblėjai?

Ši skaičiuoklė yra specialiai sukurta tradicinėms restrikcijos fermentų ir ligazės pagrindu veikiančioms klonavimo reakcijoms. Gibsono Asamblėjai rekomenduojama naudoti ekvivalentinius visų fragmentų kiekius (1:1 santykis), nors pagrindinis DNR kiekio skaičiavimas pagal ilgį yra panašus. Golden Gate Asamblėjai taip pat paprastai naudojami ekvivalentiniai visų komponentų kiekiai.

Kaip atsižvelgti į vektoriaus defosforilinimą mano skaičiavimuose?

Vektoriaus defosforilinimas (5' fosfatų grupių pašalinimas) neleidžia savarankiškai liguotis, tačiau nekeičia kiekių skaičiavimų. Tačiau defosforilintiems vektoriams:

Naudokite šviežią įterpimo DNR su nepažeistomis 5' fosfatais
Apsvarstykite galimybę naudoti šiek tiek didesnius įterpimo:vektoriaus santykius (4:1 iki 6:1)
Įsitikinkite, kad ilgiau liguojate (bent 1 valandą kambario temperatūroje arba per naktį 16°C)

Koks yra minimalus bendras reakcijos tūris, kurį turėčiau naudoti?

Minimalus praktiškas reakcijos tūris paprastai yra 10 μL, kuris leidžia pakankamai maišyti ir užkirsti kelią išgaravimui. Jei jūsų apskaičiuoti DNR tūriai viršija pageidaujamą reakcijos tūrį, turite keletą variantų:

Naudokite labiau koncentruotas DNR mėginius
Sumažinkite naudojamo vektoriaus kiekį (pvz., 25 ng vietoj 50 ng)
Padidinkite bendrą reakcijos tūrį
Apsvarstykite galimybę koncentruoti savo DNR mėginius

Kiek laiko turėčiau inkubuoti savo ligacijos reakciją?

Optimalus inkubacijos laikas skiriasi priklausomai nuo ligacijos tipo:

Klampių galų ligacijoms: 1 valanda kambario temperatūroje (22-25°C) arba 4-16 valandų 16°C
Tiesių galų ligacijoms: 2-4 valandos kambario temperatūroje arba per naktį (12-16 valandų) 16°C
Greitos ligacijos (naudojant didelės koncentracijos ligazę): 5-15 minučių kambario temperatūroje

Ar galiu pakartotinai naudoti likusią ligacijos reakciją transformacijai?

Taip, ligacijos mišiniai paprastai gali būti laikomi -20°C ir pakartotinai naudojami transformacijai. Tačiau kiekvienas užšaldymo-atšildymo ciklas gali sumažinti efektyvumą. Geriausiems rezultatams:

Apskaičiuokite ligacijos mišinį prieš užšaldydami
Karščiu inaktyvuokite ligazę (65°C 10 minučių) prieš laikydami
Naudokite per 1-2 mėnesius, kad gautumėte optimalų rezultatą

Nuorodos

Sambrook J, Russell DW. (2001). Molekulinis Klonavimas: Laboratorinė Vadovė (3-iasis leidimas). Šaltojo Pavasario Laboratorijos Leidykla.
Green MR, Sambrook J. (2012). Molekulinis Klonavimas: Laboratorinė Vadovė (4-asis leidimas). Šaltojo Pavasario Laboratorijos Leidykla.
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). Vieno puodo, vieno žingsnio, tikslus klonavimo metodas su dideliu pralaidumu. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Fermentinis DNR molekulių sujungimas iki kelių šimtų kilobazių. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligacijos nepriklausomas klonavimas PCR produktuose (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069
Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Makromolekulinė minios leidžia tiesių galų ligaciją naudojant DNR ligazes iš žiurkių kepenų arba Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852
Addgene - Molekulinės Biologijos Nuoroda. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/
New England Biolabs (NEB) - DNR Ligacijos Protokolas. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202
Thermo Fisher Scientific - Molekulinio Klonavimo Techninis Vadovas. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html
Promega - Klonavimo Techninis Vadovas. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/

DNR sujungimo skaičiuoklė molekulinės klonavimo eksperimentams

DNR Lyginimo Skaičiuoklė

Įvesties Parametrai

Lyginimo Rezultatai

Dokumentacija