DNR Ligacijos Skaičiuoklė - Apskaičiuokite Įterpinio:Vektoriaus Santykius Molekuliniam Klonavimui

DNR ligavimas yra molekulinio klonavimo etapas, kai intarpo fragmentas fermentu T4 DNR ligaze prijungiamas prie plazmidės vektoriaus. DNR ligavimo skaičiuotuvas apskaičiuoja, kiek mikrolitrų intarpo DNR ir vektoriaus DNR reikia sumaišyti, kad reakcijoje būtų pasiektas pasirinktas intarpo ir vektoriaus molinis santykis.

Ką daro skaičiuotuvas

Skaičiuotuvui pateikiami šeši įvesties duomenys: vektoriaus koncentracija, vektoriaus ilgis, intarpo koncentracija, intarpo ilgis, tikslinis intarpo ir vektoriaus molinis santykis bei bendras reakcijos tūris. Taip pat galima nustatyti, kiek vektoriaus DNR naudoti; numatytoji reikšmė yra 50 nanogramų (ng). Pagal šias reikšmes apskaičiuojamas į pipetę paimamas vektoriaus tūris, į pipetę paimamas intarpo tūris ir buferio arba vandens kiekis, kurį reikia įpilti, kad būtų pasiektas bendras reakcijos tūris.

Koncentracija matuojama nanogramais mikrolitre (ng/μL) ir paprastai nustatoma „Nanodrop“ arba „Qubit“ prietaisu. Ilgis matuojamas bazių poromis (bp). Viena kilobazė (kb) lygi 1000 bazių porų. Molinis santykis nurodo, kiek intarpo molekulių turi tekti vienai vektoriaus molekulei. Tai nėra masių santykis.

Kodėl naudojamas molinis santykis, o ne masė

Vienodos DNR masės neapima vienodo molekulių skaičiaus. Trumpas intarpas sveria mažiau nei ilgas vektorius, jei molekulių skaičius vienodas. Sumaišius vienodus trumpesnio intarpo ir ilgesnio vektoriaus nanogramų kiekius, intarpo molekulių, palyginti su vektoriaus molekulėmis, būtų gerokai per mažai. Skaičiuotuvas pakoreguoja intarpo masę pagal fragmentų ilgių santykį, kad galutiniame mišinyje vienai vektoriaus molekulei tektų numatytas intarpo molekulių skaičius.

DNR ligavimo formulė

Reikalingas intarpo DNR kiekis nanogramais yra:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

čia $m_i$ yra intarpo kiekis nanogramais, $m_v$ – vektoriaus kiekis nanogramais, $k_i$ – intarpo ilgis kilobazėmis, $k_v$ – vektoriaus ilgis kilobazėmis, o R – tikslinis intarpo ir vektoriaus molinis santykis.

Nustačius šį kiekį, skaičiuotuvas kiekvieną kiekį perskaičiuoja į tūrį, kurį galima paimti pipete:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

čia $V_v$ ir $V_i$ yra atitinkamai vektoriaus ir intarpo tūriai mikrolitrais, $c_v$ ir $c_i$ – atitinkamai vektoriaus ir intarpo koncentracijos nanogramais mikrolitre, $V_b$ – buferio tūris, o $V_t$ – bendras reakcijos tūris.

Jei vektoriaus ir intarpo tūriai kartu yra didesni už bendrą reakcijos tūrį, buferiui, ligazei ar vandeniui nebelieka vietos. Tokiu atveju skaičiuotuvas nurodo, kad bendras tūris yra per mažas, užuot rodęs neigiamą buferio kiekį.

Skaičiavimo pavyzdys

Tyrėjas klonuoja 1 kb geno fragmentą į 3 kb plazmidės vektorių. Planuojama naudoti 50 ng vektoriaus DNR, kai intarpo ir vektoriaus molinis santykis yra 3:1, o reakcijos tūris – 20 μL.

Įvesties duomenys:

• Vektoriaus koncentracija: 50 ng/μL
• Vektoriaus ilgis: 3000 bp (3 kb)
• Intarpo koncentracija: 25 ng/μL
• Intarpo ilgis: 1000 bp (1 kb)
• Molinis santykis: 3
• Bendras tūris: 20 μL
• Vektoriaus kiekis: 50 ng

1 žingsnis: intarpo kiekis

intarpo ng = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

2 žingsnis: tūriai

Vektoriaus tūris = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Intarpo tūris = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Buferio tūris = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakciją sudaro 1 μL vektoriaus, 2 μL intarpo ir 17 μL buferio arba vandens; į šį tūrį taip pat įdedama ligazė ir jos reakcijos buferis. Šiame mišinyje vienai vektoriaus molekulei tenka trys intarpo molekulės.

Įprasti ligavimo moliniai santykiai

Atliekant daugumą standartinio klonavimo procedūrų su lipniaisiais, išsikišusiais galais, naudojamas 3:1 intarpo ir vektoriaus santykis. Ligavimas, kai sujungiami bukieji galai, yra ne toks efektyvus, todėl dažnai naudojamas didesnis santykis, pavyzdžiui, 5:1. Labai dideli intarpai kartais geriau veikia, kai santykis yra mažesnis, artimesnis 1:1, nes dideli fragmentai vienai molekulei jau suteikia daug bazių porų.

Dažnai užduodami klausimai

Kas yra DNR ligavimas?

DNR ligavimas yra dviejų DNR fragmentų, paprastai plazmidės vektoriaus ir intarpo, sujungimas į vieną ištisinę molekulę. Fermentas T4 DNR ligazė sujungia fragmentų galus.

Ką reiškia intarpo ir vektoriaus molinis santykis?

Tai intarpo DNR molekulių skaičius, tenkantis vienai vektoriaus molekulei reakcijoje. Santykis 3:1 reiškia tris intarpo molekules vienai vektoriaus molekulei, nepaisant jų masių santykio.

Kodėl nenaudojami vienodi vektoriaus ir intarpo nanogramų kiekiai?

Skirtingo ilgio DNR fragmentų vienos molekulės masė skiriasi. 1 kb intarpas, vertinant vienos molekulės mastu, sveria maždaug trečdalį 3 kb vektoriaus masės. Vienodi kiekvieno fragmento nanogramų kiekiai nesudarytų vienodo molekulių skaičiaus, todėl skaičiuotuvas pakoreguoja intarpo masę, kad atitiktų tikslinį molinį santykį.

Ką reiškia, jei bendras tūris yra per mažas?

Tai reiškia, kad vien vektoriaus ir intarpo tūriai jau užima visą reakcijos tūrį, todėl nelieka vietos buferiui ar ligazei. Sprendimas – padidinti bendrą reakcijos tūrį arba naudoti labiau koncentruotas DNR atsargas.

Ar šį skaičiuotuvą galima naudoti Gibson Assembly arba Golden Gate klonavimui?

Ne. Šiems metodams taikoma kitokia reakcijos chemija, be to, paprastai siekiama ekvimolinių visų fragmentų kiekių, o ne fiksuoto intarpo ir vektoriaus santykio. Jų tūrio skaičiavimai skiriasi nuo standartinio klonavimo naudojant T4 ligazę.

Kiek vektoriaus DNR paprastai naudojama?

50 ng yra įprastas pradinis kiekis standartinei ligavimo reakcijai. Laboratorijose taip pat naudojami kiekiai nuo 25 iki 100 ng, pritaikomi pagal DNR koncentraciją ir reakcijos mastą.