Kira kepekatan DNA daripada bacaan serapan (A260) dengan faktor pencairan yang boleh disesuaikan. Alat penting untuk makmal biologi molekul dan penyelidikan genetik.
Kepekatan DNA dikira menggunakan formula berikut:
Kalkulator kepekatan DNA adalah alat dalam talian yang penting yang membantu ahli biologi molekul, genetik, dan juruteknik makmal untuk menentukan kepekatan DNA dengan tepat daripada bacaan spektrofotometrik. Kalkulator percuma ini menggunakan kaedah standard A260 untuk menukar pengukuran serapan UV kepada nilai kepekatan DNA yang tepat dalam ng/μL.
Pengukuran kepekatan DNA adalah prosedur asas di makmal biologi molekul, berfungsi sebagai langkah kawalan kualiti yang kritikal sebelum PCR, penjujukan, pengklonan, dan teknik molekul lain. Kalkulator kami menghapuskan pengiraan manual dan mengurangkan kesilapan semasa menentukan kedua-dua kepekatan dan jumlah DNA keseluruhan dalam sampel anda.
Pengiraan kepekatan DNA bergantung kepada Hukum Beer-Lambert, yang menyatakan bahawa serapan suatu larutan adalah berkadar terus dengan kepekatan spesies yang menyerap dalam larutan dan panjang jalur cahaya melalui larutan. Untuk DNA dua helai, serapan 1.0 pada 260nm (A260) dalam cuvette panjang jalur 1cm bersamaan dengan kepekatan kira-kira 50 ng/μL.
Kepekatan DNA dikira menggunakan formula berikut:
Di mana:
Jumlah keseluruhan DNA dalam sampel kemudian boleh dikira dengan:
Serapan pada 260nm (A260):
Faktor Penukaran (50):
Faktor Pencairan:
Volume:
Ikuti proses mudah ini untuk mengira kepekatan DNA daripada bacaan A260 anda:
Pengukuran kepekatan DNA adalah penting untuk pelbagai aplikasi biologi molekul dan penyelidikan:
Sebelum mengikat fragmen DNA ke dalam vektor, mengetahui kepekatan tepat membolehkan penyelidik mengira nisbah masukkan-ke-vektor yang optimum, memaksimumkan kecekapan transformasi. Sebagai contoh, nisbah molar 3:1 bagi masukkan kepada vektor sering memberikan hasil terbaik, yang memerlukan pengukuran kepekatan yang tepat bagi kedua-dua komponen.
Reaksi PCR biasanya memerlukan 1-10 ng DNA templat untuk penguatan optimum. DNA yang terlalu sedikit mungkin menyebabkan kegagalan penguatan, manakala terlalu banyak boleh menghalang reaksi. Untuk PCR kuantitatif (qPCR), pengukuran DNA yang lebih tepat diperlukan untuk memastikan lengkung standard yang tepat dan pengukuran yang boleh dipercayai.
Protokol penyediaan perpustakaan NGS menentukan jumlah input DNA yang tepat, sering dalam julat 1-500 ng bergantung kepada platform dan aplikasi. Pengukuran kepekatan yang tepat adalah penting untuk penyediaan perpustakaan yang berjaya dan perwakilan seimbang sampel dalam larian penjujukan berganda.
Apabila memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, jumlah DNA optimum berbeza mengikut jenis sel dan kaedah transfeksi. Biasanya, 0.5-5 μg DNA plasmid digunakan setiap telaga dalam format plat 6-telaga, memerlukan pengukuran kepekatan yang tepat untuk menstandardkan eksperimen.
Dalam aplikasi forensik, sampel DNA sering terhad dan berharga. Pengukuran yang tepat membolehkan saintis forensik menentukan sama ada DNA yang mencukupi ada untuk profil dan untuk menstandardkan jumlah DNA yang digunakan dalam analisis seterusnya.
Enzim restriksi mempunyai unit aktiviti tertentu yang ditakrifkan setiap μg DNA. Mengetahui kepekatan DNA yang tepat membolehkan nisbah enzim-ke-DNA yang betul, memastikan pencernaan lengkap tanpa aktiviti bintang (pemotongan tidak spesifik).
Walaupun spektrofotometri UV adalah kaedah yang paling biasa untuk pengukuran DNA, beberapa alternatif wujud:
Kaedah Fluorometrik:
Elektroforesis Gel Agarose:
PCR Masa Nyata:
PCR Digital:
Keupayaan untuk mengukur kepekatan DNA dengan tepat telah berkembang dengan ketara seiring dengan kemajuan dalam biologi molekul:
Selepas penemuan struktur DNA oleh Watson dan Crick pada tahun 1953, saintis mula membangunkan kaedah untuk mengasingkan dan mengukur DNA. Pendekatan awal bergantung kepada ujian kolorimetri seperti reaksi diphenylamine, yang menghasilkan warna biru apabila bertindak balas dengan gula deoksiribosa dalam DNA. Kaedah ini agak tidak sensitif dan terdedah kepada gangguan.
Penggunaan spektrofotometri UV untuk pengukuran asid nukleik menjadi meluas pada tahun 1970-an. Saintis mendapati bahawa DNA menyerap cahaya UV dengan maksimum pada 260nm, dan bahawa hubungan antara serapan dan kepekatan adalah linear dalam julat tertentu. Faktor penukaran 50 ng/μL untuk DNA dua helai pada A260 = 1.0 ditetapkan semasa tempoh ini.
Pembangunan pewarna fluoresen khusus DNA pada tahun 1980-an dan 1990-an merevolusikan pengukuran DNA, terutamanya untuk sampel yang dicairkan. Pewarna Hoechst dan kemudian PicoGreen membolehkan pengesanan yang jauh lebih sensitif daripada yang mungkin dengan spektrofotometri. Kaedah ini menjadi sangat penting dengan kemunculan PCR, yang sering memerlukan pengukuran tepat jumlah DNA yang sangat kecil.
Pengenalan spektrofotometer mikrovolume seperti NanoDrop pada awal 2000-an mengubah pengukuran kepekatan DNA rutin dengan hanya memerlukan 0.5-2 μL sampel. Teknologi ini menghapuskan keperluan untuk pencairan dan cuvette, menjadikan proses lebih cepat dan lebih mudah.
Hari ini, teknik canggih seperti PCR digital dan penjujukan generasi seterusnya telah mendorong sempadan pengukuran DNA lebih jauh, membolehkan pengukuran mutlak urutan tertentu dan pengesanan molekul tunggal. Namun, prinsip spektrofotometrik asas yang ditetapkan beberapa dekad lalu tetap menjadi tulang belakang pengukuran kepekatan DNA rutin di makmal di seluruh dunia.
Mari kita lihat beberapa contoh praktikal pengiraan kepekatan DNA:
Seorang penyelidik telah memurnikan plasmid dan memperoleh pengukuran berikut:
Pengiraan:
Selepas mengekstrak DNA genomik daripada darah:
Pengiraan:
Protokol penjujukan memerlukan tepat 500 ng DNA:
Volume yang diperlukan = 500 ÷ 125 = 4 μL larutan DNA
Berikut adalah contoh cara mengira kepekatan DNA dalam pelbagai bahasa pengaturcaraan:
1' Formula Excel untuk kepekatan DNA
2=A260*50*FaktorPencairan
3
4' Formula Excel untuk jumlah DNA dalam μg
5=(A260*50*FaktorPencairan*Volume)/1000
6
7' Contoh dalam sel dengan A260=0.5, FaktorPencairan=2, Volume=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Hasil: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Kira kepekatan DNA dalam ng/μL
4
5 Parameter:
6 absorbance (float): Bacaan serapan pada 260nm
7
8 Mengembalikan:
9 float: Kepekatan DNA dalam ng/μL
10 """
11 return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14 """
15 Kira jumlah DNA dalam μg
16
17 Parameter:
18 concentration (float): Kepekatan DNA dalam ng/μL
19 volume_ul (float): Volume larutan DNA dalam μL
20
21 Mengembalikan:
22 float: Jumlah DNA dalam μg
23 """
24 return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# Contoh penggunaan
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"Kepekatan DNA: {concentration:.2f} ng/μL")
35print(f"Jumlah DNA: {total_dna:.2f} μg")
361function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2 // Mengembalikan kepekatan DNA dalam ng/μL
3 return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7 // Mengembalikan jumlah DNA dalam μg
8 return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// Contoh penggunaan
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`Kepekatan DNA: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`Jumlah DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
211public class DNACalculator {
2 /**
3 * Kira kepekatan DNA dalam ng/μL
4 *
5 * @param absorbance Bacaan serapan pada 260nm
6 * @param dilutionFactor Faktor pencairan sampel
7 * @return Kepekatan DNA dalam ng/μL
8 */
9 public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10 return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11 }
12
13 /**
14 * Kira jumlah DNA dalam μg
15 *
16 * @param concentration Kepekatan DNA dalam ng/μL
17 * @param volumeUL Volume larutan DNA dalam μL
18 * @return Jumlah DNA dalam μg
19 */
20 public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21 return (concentration * volumeUL) / 1000;
22 }
23
24 public static void main(String[] args) {
25 double absorbance = 0.42;
26 double dilutionFactor = 3;
27 double volume = 150;
28
29 double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30 double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31
32 System.out.printf("Kepekatan DNA: %.2f ng/μL%n", concentration);
33 System.out.printf("Jumlah DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34 }
35}
36# Fungsi R untuk pengiraan kepekatan DNA calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) { # Mengembalikan kepekatan DNA dalam ng/μL return(absorbance * 50 * dilution_factor) } calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) { # Mengembalikan jumlah DNA dalam μg return((concentration * volume_ul) / 1000)
Temui lebih banyak alat yang mungkin berguna untuk aliran kerja anda