Kalkulator Kepekatan DNA | Pengubah A260 ke ng/μL

Kalkulator Kepekatan DNA

Kalkulator kepekatan DNA menukarkan bacaan serapan UV pada 260 nanometer, yang dipanggil A260, kepada kepekatan DNA dalam nanogram per mikroliter (ng/µL). Kalkulator ini juga melaporkan jumlah DNA dalam sampel, dalam mikrogram (µg).

Apakah serapan A260?

A260 ialah jumlah cahaya ultraungu yang diserap oleh sesuatu larutan pada panjang gelombang 260 nanometer. DNA menyerap cahaya UV paling kuat berhampiran panjang gelombang ini kerana bes nukleotidanya. Spektrofotometer mengukur A260 selepas bacaan blanko, dengan menggunakan penimbal yang sama seperti sampel untuk menyingkirkan serapan latar belakang. Semakin banyak DNA dalam larutan, semakin tinggi bacaan A260.

Formula kepekatan DNA

DNA untai ganda menyerap cahaya UV berkadar dengan kepekatannya, iaitu hubungan yang dikenali sebagai hukum Beer-Lambert. Dalam laluan cahaya sepanjang 1 sentimeter, larutan dengan bacaan A260 sebanyak 1.0 mengandungi kira-kira 50 ng/µL DNA untai ganda. Nombor ini, iaitu faktor penukaran, menukarkan mana-mana bacaan A260 kepada kepekatan:

Kepekatan DNA (ng/µL) = A260 × 50 × faktor pencairan

Faktor pencairan mengambil kira sebarang pencairan yang dibuat sebelum sampel diukur. Sampel yang diukur tanpa pencairan mempunyai faktor pencairan 1.

Cara mengira hasil DNA keseluruhan

Setelah kepekatan diketahui, jisim keseluruhan DNA dalam sampel boleh ditentukan daripada isipadunya:

Jumlah DNA (µg) = kepekatan (ng/µL) × isipadu (µL) ÷ 1000

Cara mengira kepekatan DNA: langkah demi langkah

1. Campurkan sampel dengan teliti sebelum mengukurnya. DNA boleh melekat pada dinding tiub atau mendap secara tidak sekata.
2. Cairkan sampel jika kepekatannya tinggi, dengan menyasarkan bacaan A260 antara 0.1 dan 1.0. Bacaan spektrofotometer paling tidak boleh dipercayai di luar julat tersebut.
3. Lakukan blanko spektrofotometer menggunakan penimbal yang sama seperti yang digunakan untuk pencairan, kemudian ukur sampel pada 260 nm.
4. Masukkan bacaan A260, isipadu sampel dan faktor pencairan ke dalam kalkulator untuk mendapatkan kepekatan dan hasil keseluruhan. Ketiga-tiga kotak mesti diisi, dan isipadu mestilah lebih besar daripada sifar, sebelum keputusan dipaparkan.

Contoh pengiraan

Contoh 1: sampel tidak dicairkan

Bacaan A260 sebanyak 0.5, tanpa pencairan (faktor pencairan 1), dan isipadu sampel sebanyak 100 µL.

• Kepekatan = 0.5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Jumlah DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2.5 µg

Contoh 2: sampel dicairkan

Sebuah tiub mengandungi 50 µL DNA yang telah ditulenkan. Sebahagian kecil daripadanya dicairkan sebanyak 10 kali ganda, dan bahagian yang dicairkan itu memberikan bacaan A260 sebanyak 0.75. Faktor pencairan menukarkan bacaan itu kembali kepada kepekatan dalam tiub asal, manakala 50 µL ialah isipadu yang dimasukkan untuk langkah pengiraan hasil keseluruhan.

• Kepekatan = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Jumlah DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18.75 µg

Mengira faktor pencairan

Faktor pencairan = jumlah isipadu selepas pencairan ÷ isipadu sampel asal.

Penambahan 5 µL larutan DNA kepada 45 µL penimbal menghasilkan jumlah isipadu 50 µL, maka faktor pencairan ialah 50 ÷ 5 = 10. Sampel yang tidak dicairkan mempunyai faktor pencairan 1.

Julat kepekatan DNA yang lazim

Kepekatan bergantung pada jenis sampel dan kaedah pengekstrakan. Pengekstrakan DNA genom lazimnya berada antara kira-kira 10 dan 100 ng/µL. Penyediaan DNA plasmid sering menghasilkan kepekatan yang lebih tinggi, kadangkala beberapa ratus ng/µL. Keputusan yang jauh di luar julat jangkaan bagi sesuatu kaedah mungkin menunjukkan masalah pada pengekstrakan atau pengukuran itu sendiri.

Had pengukuran serapan UV

Pengukuran A260 adalah pantas, tetapi bukan kaedah yang paling sensitif atau khusus untuk DNA. Protein, RNA dan sesetengah komponen penimbal turut menyerap cahaya berhampiran 260 nm dan boleh meningkatkan bacaan. Saintis sering memeriksa nisbah A260/A280 bersama-sama kepekatan untuk menyaring pencemaran protein; nisbah hampir 1.8 biasanya menunjukkan sampel DNA yang tulen. Kaedah berasaskan pewarna pendarfluor, seperti ujian Qubit, hanya mengikat DNA untai ganda dan memberikan bacaan yang lebih tepat untuk sampel cair atau tidak tulen, walaupun kaedah ini memerlukan reagen tambahan dan fluorometer.

Soalan lazim

Bagaimanakah kepekatan DNA dikira daripada A260?

Darabkan bacaan A260 dengan 50, iaitu faktor penukaran piawai untuk DNA untai ganda, kemudian darabkan dengan faktor pencairan. Jika sampel tidak dicairkan, gunakan faktor pencairan 1.

Apakah nisbah A260/A280 yang baik?

Nisbah hampir 1.8 biasanya menunjukkan sampel DNA yang tulen. Nisbah yang lebih rendah menunjukkan pencemaran protein. Nisbah melebihi 2.0 mungkin menunjukkan pencemaran RNA.

Bolehkah kalkulator ini digunakan untuk RNA?

Tidak secara langsung, kerana RNA menggunakan faktor penukaran 40 ng/µL dan bukannya 50. Untuk menganggarkan kepekatan RNA, darabkan keputusan kalkulator dengan 0.8 (40 ÷ 50), atau gunakan A260 × 40 × faktor pencairan secara langsung.

Mengapakah bacaan A260 perlu berada antara 0.1 dan 1.0?

Serapan kekal kira-kira berkadar dengan kepekatan, seperti yang diterangkan oleh hukum Beer-Lambert, terutamanya dalam julat ini. Di luarnya, bacaan menjadi kurang boleh dipercayai, maka sampel yang terlalu pekat atau terlalu cair perlu dicairkan atau dipekatkan sebelum diukur semula.

Apakah perbezaan antara kepekatan dan ketulenan?

Kepekatan mengukur jumlah DNA yang ada, dalam ng/µL. Ketulenan mengukur kebersihan sampel, yang dinilai terutamanya melalui nisbah serapan seperti A260/A280. Sampel boleh mempunyai kepekatan yang tinggi tetapi masih tidak tulen, atau kepekatan yang rendah tetapi sangat tulen.

Bagaimanakah ng/µL ditukar kepada µg/mL?

Kedua-dua unit itu sama dari segi nilai angka. 1 ng/µL bersamaan dengan 1 µg/mL, kerana unit jisim dan unit isipadu masing-masing diskalakan dengan faktor 1000.

Rujukan

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edisi ke-3). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Kuantifikasi DNA dan RNA dengan spektroskopi serapan dan pendarfluor. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Nilai nisbah A260/A280 untuk pengukuran ketulenan asid nukleik. BioTechniques, 19(2), 208–210.