Kalkulator Kepekatan Protein | A280 hingga mg/mL

Kalkulator kepekatan protein

Kalkulator kepekatan protein menukarkan bacaan serapan cahaya daripada spektrofotometer kepada jumlah protein yang terlarut dalam larutan. Hasil biasanya diberikan dalam miligram per mililiter (mg/mL) atau mikrogram per mililiter (μg/mL). Pengiraan ini berdasarkan hukum Beer-Lambert, iaitu hubungan dalam kimia yang mengaitkan jumlah cahaya yang diserap oleh sampel dengan jumlah sesuatu bahan yang terkandung di dalamnya.

Cara kepekatan protein diukur

Kebanyakan protein menyerap cahaya ultraungu dengan kuat pada panjang gelombang 280 nanometer (nm). Serapan ini terutamanya berpunca daripada dua asid amino, triptofan dan tirosina, yang terdapat dalam struktur protein. Spektrofotometer memancarkan cahaya melalui sampel dan mengukur jumlah cahaya yang diserap oleh sampel tersebut. Bacaan ini dipanggil serapan, atau A280 apabila diambil pada 280 nm.

Pengukuran serapan pada 280 nm adalah pantas dan tidak memusnahkan sampel. Hal ini membezakannya daripada kaedah kimia seperti ujian Bradford atau BCA yang diterangkan di bawah. Kaedah ini paling sesuai untuk protein tulen dalam larutan, dengan bacaan serapan antara kira-kira 0.1 hingga 1.0. Bacaan di luar julat ini kurang boleh dipercayai, jadi sampel selalunya perlu dicairkan sebelum pengukuran.

Rumus kepekatan protein

Kalkulator menyusun semula hukum Beer-Lambert untuk mendapatkan kepekatan:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — kepekatan protein, dalam mg/mL
• A — serapan pada 280 nm (nombor biasa, tanpa unit)
• DF — faktor pencairan, iaitu berapa kali sampel asal dicairkan sebelum diukur
• ε — pekali pemadaman, pemalar khusus untuk protein tersebut, dalam L/(g·cm)
• l — panjang lintasan, iaitu jarak yang dilalui cahaya melalui sampel, dalam cm (biasanya 1 cm dalam kuvet piawai, bekas kaca atau plastik kecil yang digunakan dalam spektrofotometer)

Untuk menukarkan hasil kepada mikrogram per mililiter, darabkan nilai mg/mL dengan 1,000. Untuk mendapatkan jumlah jisim protein dalam sampel, darabkan kepekatan dengan isipadu sampel dalam mililiter.

Contoh pengiraan

Sampel memberikan bacaan serapan sebanyak 0.5 pada 280 nm. Sampel itu tidak dicairkan, jadi faktor pencairannya ialah 1, dan pengukurannya dibuat dalam kuvet piawai 1 cm. Protein tersebut ialah albumin serum lembu (BSA), yang mempunyai pekali kepupusan sebanyak 0.667 L/(g·cm).

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/mL

Dalam sampel sebanyak 1 mL, jumlah itu kira-kira 0.75 mg protein, atau 750 μg/mL.

Pekali kepupusan bagi protein biasa

Setiap protein menyerap cahaya secara berbeza kerana setiap protein mempunyai bilangan residu triptofan dan tirosina yang berbeza. Pekali kepupusan menerangkan ciri ini bagi protein tertentu pada 280 nm, dalam unit L/(g·cm). Nilai yang biasa digunakan termasuk:

Kalkulator juga boleh menerima pekali kepupusan tersuai bagi protein yang tiada dalam senarai ini. Bagi protein yang mempunyai jujukan asid amino yang diketahui, nilai ini boleh dianggarkan menggunakan rumus yang diterbitkan oleh Gill dan von Hippel pada 1989: ε₂₈₀ = (residu triptofan × 5,500) + (residu tirosina × 1,490) + (residu sistina × 125). Rumus itu memberikan hasil dalam M⁻¹cm⁻¹, iaitu unit molar yang berbeza daripada nilai berasaskan jisim L/(g·cm) di atas. Alat percuma seperti ProtParam, yang dihoskan oleh pelayan ExPASy, mengira nilai ini secara langsung daripada jujukan protein.

Panjang lintasan dan faktor pencairan

Panjang lintasan ialah lebar kuvet yang menampung sampel, diukur dalam sentimeter. Kuvet piawai mempunyai lebar 1 cm. Spektrofotometer mikroisipadu, yang mengukur sampel yang sangat kecil, mungkin menggunakan lintasan yang jauh lebih pendek, seperti 0.1 cm.

Faktor pencairan mengambil kira sebarang pencairan yang dilakukan sebelum pengukuran. Jika sampel pekat memberikan serapan melebihi 1.0, sampel itu biasanya dicairkan terlebih dahulu dengan penimbal. Faktor pencairan sama dengan jumlah isipadu yang dicairkan dibahagikan dengan isipadu sampel asal. Sebagai contoh, mencampurkan 10 μL sampel dengan 990 μL penimbal memberikan jumlah isipadu 1,000 μL, dengan faktor pencairan sebanyak 100.

Kaedah lain untuk mengukur kepekatan protein

Serapan pada 280 nm ialah salah satu daripada beberapa kaedah biasa yang digunakan di makmal.

• Ujian Bradford: menggunakan pewarna yang berubah warna apabila mengikat protein. Kaedah ini berfungsi dengan baik pada sampel yang tidak ditulenkan, tetapi perubahan warna boleh berbeza antara protein yang berlainan.
• Ujian BCA: bergantung pada perubahan warna yang disebabkan oleh ikatan peptida protein. Kaedah ini serasi dengan banyak detergen tetapi mengambil masa lebih lama berbanding bacaan serapan langsung.
• Kaedah Lowry: kaedah yang lebih lama dan sangat sensitif, tetapi bertindak balas dengan kurang baik terhadap sesetengah bahan penimbal yang biasa digunakan.

Setiap satu daripada tiga kaedah ini memusnahkan sampel. Pengukuran A280 secara langsung tidak berbuat demikian, jadi sampel yang sama boleh diperoleh semula dan digunakan sekali lagi.

Soalan lazim

Apakah julat serapan yang ideal untuk kaedah ini?

Antara 0.1 hingga 1.0. Di bawah 0.1, bacaan kurang tepat. Di atas 1.0, hubungan antara serapan dengan kepekatan mungkin tidak lagi berupa garis lurus, jadi sampel hendaklah dicairkan terlebih dahulu.

Mengapa mengukur pada 280 nm dan bukannya 260 nm?

Asid nukleik seperti DNA dan RNA menyerap dengan kuat pada 260 nm. Protein menyerap lebih banyak pada 280 nm kerana kandungan triptofan dan tirosin. Pengukuran pada 280 nm mengurangkan gangguan daripada sebarang asid nukleik yang terdapat dalam sampel.

Bagaimanakah pekali kepupusan ditentukan bagi protein yang tiada dalam senarai?

Bagi protein yang mempunyai jujukan yang diketahui, alat seperti ProtParam mengiranya berdasarkan bilangan residu triptofan, tirosina dan sistina. Nilai itu juga boleh diukur secara langsung dengan membandingkan serapan sampel dengan larutan yang mempunyai kepekatan diketahui.

Adakah kaedah ini berfungsi untuk campuran protein?

Kaedah ini paling sesuai untuk satu protein tulen yang mempunyai pekali kepupusan yang diketahui. Campuran protein yang tidak diketahui, seperti lisat sel, biasanya diukur menggunakan ujian Bradford atau BCA kerana kaedah tersebut memberikan anggaran jumlah protein yang lebih konsisten.

Bolehkah detergen mengganggu bacaan?

Ya. Banyak detergen menyerap cahaya berhampiran 280 nm, yang boleh memesongkan hasil. Penggunaan sampel kosong yang mengandungi kepekatan detergen yang sama membantu membatalkan serapan latar belakang tersebut. Kepekatan detergen yang sangat tinggi mungkin memerlukan ujian yang serasi dengan detergen, seperti BCA.