Kalkulator Suhu Penggabungan DNA | Alat Tm PCR Percuma

Apakah kalkulator suhu pengalingan DNA?

Kalkulator suhu pengalingan DNA menganggarkan suhu lebur (Tm) primer DNA berdasarkan jujukannya. Tm ialah suhu apabila separuh molekul primer terikat pada untai sasaran dan separuh lagi tidak terikat. Dalam tindak balas rantai polimerase (PCR), nilai ini menjadi panduan bagi suhu yang digunakan untuk primer melekat pada templat DNA.

Mengapa suhu penyepuhan penting dalam PCR

PCR menyalin bahagian DNA sasaran melalui kitaran pemanasan dan penyejukan berulang. Setiap kitaran mempunyai tiga langkah. Pertama, pemanasan memisahkan templat beruntai ganda pada sekitar 95 °C. Langkah ini dipanggil denaturasi. Kedua, tindak balas disejukkan kepada suhu pengalingan, biasanya antara 50 °C dan 65 °C, supaya primer pendek dapat mengikat jujukan sepadan pada untai DNA tunggal. Ketiga, suhu meningkat kepada kira-kira 72 °C, dan enzim yang dipanggil DNA polimerase memanjangkan primer untuk membina untai DNA baharu.

Jika suhu pengalingan terlalu rendah, primer mengikat jujukan yang hanya sepadan sebahagiannya, lalu menghasilkan serpihan DNA tambahan yang tidak diingini. Jika terlalu tinggi, primer tidak dapat membentuk ikatan yang stabil dengan templat, dan hanya sedikit atau tiada DNA disalin. Suhu pengalingan ialah salah satu tetapan pertama yang dilaraskan oleh penyelidik apabila tindak balas PCR gagal.

Bagaimana kandungan GC mempengaruhi Tm

Primer berpasangan dengan sasarannya melalui ikatan hidrogen. Pasangan guanina-sitosina (G-C) membentuk tiga ikatan hidrogen. Pasangan adenina-timina (A-T) membentuk dua. Primer yang mempunyai lebih banyak bes G dan C memerlukan lebih banyak haba untuk dipisahkan, maka Tm-nya lebih tinggi berbanding primer yang sama panjang tetapi mempunyai lebih banyak bes A dan T. Kandungan GC biasanya ditulis sebagai peratusan: bilangan bes G dan C dibahagikan dengan jumlah panjang jujukan, kemudian didarab dengan 100.

Formula suhu pengalingan DNA

Kalkulator ini menggunakan salah satu daripada dua formula, yang dipilih berdasarkan panjang primer.

Bagi primer yang terdiri daripada 14 nukleotida atau lebih, formula kandungan GC Marmur-Doty digunakan:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Di sini, N_GC ialah bilangan bes G dan C dalam primer, yang dikira secara langsung dan bukannya sebagai peratusan. N ialah jumlah bilangan bes.

Bagi primer yang lebih pendek daripada 14 nukleotida, kaedah Wallace digunakan:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G dan C masing-masing mewakili bilangan bes tersebut dalam primer.

Kedua-dua formula mengandaikan keadaan PCR biasa: kira-kira 50 nanomolar primer dan 50 milimolar Na+.

Contoh pengiraan

Ambil primer 19 bes ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Panjangnya ialah 19, iaitu 14 atau lebih, jadi kalkulator menggunakan formula Marmur-Doty.

• Panjang (N) = 19
• Bilangan G = 5, bilangan C = 5, maka N_GC = 10, dan kandungan GC ialah 10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19 = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19 = 64.9 − 13.8 ≈ 51.1 °C

Formula ini menggunakan bilangan GC, 10, bukannya peratusan GC, 52.6. Jika peratusan itu tersilap digunakan, Tm yang diperoleh adalah hampir 143 °C, yang bukan nilai realistik bagi tindak balas PCR yang berjalan antara 50 °C dan 95 °C.

Cara menggunakan kalkulator ini

Taip atau tampal jujukan primer dengan hanya menggunakan huruf A, T, G dan C. Kalkulator memaparkan panjang jujukan dalam nukleotida (nt), kandungan GC sebagai peratusan, dan suhu pengalingan yang dikira, dalam darjah Celsius. Hasilnya boleh disalin untuk nota makmal atau protokol.

Memilih suhu penyepuhan PCR

Tm ialah anggaran yang dikira, bukan suhu operasi yang terjamin. Banyak protokol memulakan langkah pengalingan sebenar beberapa darjah di bawah Tm yang dikira, kemudian melaraskannya berdasarkan hasil pada gel. Bagi pasangan primer, nilai Tm yang lebih rendah antara kedua-dua primer biasanya digunakan sebagai titik permulaan. PCR bergradien, yang menjalankan beberapa tindak balas pada suhu berbeza serentak, ialah kaedah biasa untuk mencari suhu terbaik melalui pengujian.

Cara lain untuk menganggarkan Tm

Formula Marmur-Doty dan Wallace yang digunakan di sini ialah anggaran pantas yang hanya berdasarkan komposisi bes. Kaedah lain juga wujud:

• Kaedah termodinamik jiran terdekat mengambil kira pengaruh setiap pasangan bes bersebelahan terhadap kestabilan, dan dianggap sebagai kaedah yang lebih tepat untuk primer piawai.
• Formula yang dilaraskan mengikut kepekatan garam menyertakan pembetulan bagi kepekatan ion Na+ atau K+ dalam penimbal tindak balas, kerana kepekatan garam yang lebih tinggi menstabilkan dupleks DNA dan meningkatkan Tm.

Kalkulator yang berbeza boleh melaporkan nilai Tm yang berbeza bagi primer yang sama kerana menggunakan formula yang berbeza. Menjalankan PCR dan memeriksa hasilnya tetap menjadi ujian akhir.

Soalan lazim

Apakah suhu penyepuhan DNA?

Suhu ini ialah suhu apabila primer DNA mengikat jujukan sepadannya pada untai templat semasa PCR. Makmal biasanya menetapkannya beberapa darjah di bawah suhu lebur primer (Tm) yang dikira.

Bagaimanakah Tm primer dikira?

Bagi primer yang terdiri daripada 14 bes atau lebih, Tm = 64.9 + 41 × (bilangan GC − 16.4) / panjang. Bagi primer yang lebih pendek daripada 14 bes, Tm = 2 × (bilangan A+T) + 4 × (bilangan G+C).

Mengapa kandungan GC meningkatkan Tm?

Pasangan bes G-C membentuk tiga ikatan hidrogen, berbanding dua bagi pasangan A-T. Primer yang mempunyai bahagian bes G dan C yang lebih tinggi memerlukan lebih banyak tenaga, dan oleh itu suhu yang lebih tinggi, untuk berpisah daripada sasarannya.

Patutkah suhu pengalingan PCR sama dengan Tm yang dikira?

Tidak. Kebanyakan protokol bermula beberapa darjah di bawah Tm yang dikira dan melarasnya dari situ, kerana Tm menandakan titik apabila hanya separuh primer terikat.

Adakah panjang primer mengubah Tm?

Ya, walaupun bukan dengan cara yang mudah. Panjang berada pada penyebut formula Marmur-Doty, jadi primer yang lebih panjang dengan kandungan GC purata tidak semestinya mempunyai Tm lebih tinggi daripada primer yang lebih pendek tetapi kaya dengan GC.

Mengapa kalkulator Tm yang berbeza memberikan hasil yang tidak sama?

Kalkulator tersebut menggunakan formula yang berbeza. Kaedah Wallace, formula kandungan GC Marmur-Doty, termodinamik jiran terdekat dan formula terlaras garam masing-masing boleh memberikan Tm yang berbeza bagi primer yang sama, kadangkala dengan perbezaan beberapa darjah.

Rujukan

1. Marmur J, Doty P. Penentuan komposisi bes asid deoksiribonukleik berdasarkan suhu denaturasi termanya. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Penghibridan oligodeoksiribonukleotida sintetik dengan DNA phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Pandangan bersatu tentang termodinamik jiran terdekat DNA polimer, dumbel dan oligonukleotida. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.