Kalkulator Ligation DNA

Pengenalan

Ligation DNA adalah teknik biologi molekul yang penting digunakan untuk menyambungkan fragmen DNA bersama dengan ikatan kovalen. Kalkulator Ligation DNA adalah alat penting bagi para peneliti, membantu menentukan jumlah optimal vektor dan DNA sisipan yang diperlukan untuk reaksi ligasi yang berjaya. Dengan mengira nisbah molar yang betul antara DNA vektor (plasmid) dan fragmen DNA sisipan, kalkulator ini memastikan eksperimen kloning molekul yang efisien sambil meminimumkan pembaziran reagen dan reaksi yang gagal.

Reaksi ligasi adalah asas kepada kejuruteraan genetik, biologi sintetik, dan prosedur kloning molekul. Ia membolehkan saintis mencipta molekul DNA rekombinan dengan memasukkan gen yang diminati ke dalam vektor plasmid untuk transformasi seterusnya ke dalam organisma tuan. Kejayaan reaksi ini sangat bergantung kepada penggunaan jumlah komponen DNA yang sesuai, yang tepatnya dibantu oleh kalkulator ini.

Sama ada anda sedang membina vektor ekspresi, mencipta perpustakaan gen, atau melakukan subkloning rutin, kalkulator ligation DNA ini akan membantu anda mengoptimumkan keadaan eksperimen anda dan meningkatkan kadar kejayaan anda. Dengan memasukkan beberapa parameter utama tentang sampel DNA anda, anda boleh dengan cepat mendapatkan jumlah yang tepat yang diperlukan untuk reaksi ligasi spesifik anda.

Formula/Perhitungan

Kalkulator ligation DNA menggunakan formula biologi molekul asas yang mengambil kira saiz dan kepekatan fragmen DNA yang berbeza yang disambungkan. Perhitungan utama menentukan berapa banyak DNA sisipan yang diperlukan berbanding dengan DNA vektor berdasarkan panjang masing-masing dan nisbah molar yang diingini.

Pengiraan Jumlah Sisipan

Jumlah DNA sisipan yang diperlukan (dalam nanogram) dikira menggunakan formula berikut:

$\text{ng sisipan} = \text{ng vektor} \times \frac{\text{saiz kb sisipan}}{\text{saiz kb vektor}} \times \text{nisbah molar}$

Di mana:

• ng vektor = jumlah DNA vektor yang digunakan dalam reaksi (biasanya 50-100 ng)
• saiz kb sisipan = panjang fragmen DNA sisipan dalam kilobase (kb)
• saiz kb vektor = panjang DNA vektor dalam kilobase (kb)
• nisbah molar = nisbah yang diingini bagi molekul sisipan kepada molekul vektor (biasanya 3:1 hingga 5:1)

Pengiraan Volume

Setelah jumlah DNA sisipan yang diperlukan ditentukan, volume yang diperlukan untuk reaksi dikira:

$\text{volume vektor (μL)} = \frac{\text{ng vektor}}{\text{kepekatan vektor (ng/μL)}}$

$\text{volume sisipan (μL)} = \frac{\text{ng sisipan}}{\text{kepekatan sisipan (ng/μL)}}$

$\text{volume buffer/air (μL)} = \text{Jumlah volume reaksi (μL)} - \text{volume vektor (μL)} - \text{volume sisipan (μL)}$

Contoh Pengiraan

Mari kita lalui contoh praktikal:

• Kepekatan vektor: 50 ng/μL
• Panjang vektor: 3000 bp (3 kb)
• Kepekatan sisipan: 25 ng/μL
• Panjang sisipan: 1000 bp (1 kb)
• Nisbah molar yang diingini (sisipan:vektor): 3:1
• Jumlah volume reaksi: 20 μL
• Jumlah vektor yang digunakan: 50 ng

Langkah 1: Kira jumlah sisipan yang diperlukan $\text{ng sisipan} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Langkah 2: Kira volume $\text{volume vektor} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{volume sisipan} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{volume buffer/air} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Pengiraan ini memastikan bahawa terdapat tiga molekul sisipan untuk setiap molekul vektor dalam reaksi, mengoptimumkan peluang kejayaan ligasi.

Panduan Langkah demi Langkah untuk Menggunakan Kalkulator

Kalkulator Ligation DNA kami direka untuk menjadi intuitif dan mudah. Ikuti langkah-langkah ini untuk mengira volume optimal untuk reaksi ligasi anda:

1. Masukkan Maklumat Vektor:

   • Masukkan kepekatan vektor anda dalam ng/μL
   • Masukkan panjang vektor dalam pasangan asas (bp)
   • Nyatakan jumlah DNA vektor yang ingin anda gunakan dalam reaksi (ng)

2. Masukkan Maklumat Sisipan:

   • Masukkan kepekatan sisipan anda dalam ng/μL
   • Masukkan panjang sisipan dalam pasangan asas (bp)

3. Tetapkan Parameter Reaksi:

   • Nyatakan nisbah molar yang diingini (sisipan:vektor) - biasanya antara 3:1 dan 5:1
   • Masukkan jumlah volume reaksi dalam μL (biasanya 10-20 μL)

4. Lihat Keputusan:

   • Kalkulator akan secara automatik memaparkan:
     • Volume vektor yang diperlukan (μL)
     • Volume sisipan yang diperlukan (μL)
     • Volume buffer/air yang perlu ditambah (μL)
     • Jumlah volume reaksi (μL)
     • Jumlah vektor dan DNA sisipan dalam reaksi (ng)

5. Salin Keputusan (pilihan):

   • Gunakan butang "Salin Keputusan" untuk menyalin semua pengiraan ke papan klip anda untuk buku nota atau protokol makmal anda

Kalkulator melakukan pemeriksaan pengesahan untuk memastikan semua input adalah nombor positif dan bahawa jumlah keseluruhan mencukupi untuk volume DNA yang diperlukan. Jika sebarang ralat dikesan, mesej ralat yang berguna akan membimbing anda untuk membetulkan input.

Kes Penggunaan

Kalkulator Ligation DNA adalah berharga dalam pelbagai aplikasi biologi molekul:

Kloning Molekul

Kes penggunaan yang paling biasa adalah kloning molekul standard, di mana para peneliti memasukkan gen atau fragmen DNA ke dalam vektor plasmid. Kalkulator memastikan keadaan optimal untuk:

• Subkloning gen antara vektor ekspresi yang berbeza
• Mencipta protein gabungan dengan menyambungkan beberapa fragmen gen
• Membina ujian gen pelapor
• Membangunkan perpustakaan plasmid

Biologi Sintetik

Dalam biologi sintetik, di mana beberapa fragmen DNA sering disusun:

• Reaksi Gibson Assembly mendapat manfaat daripada nisbah sisipan:vektor yang tepat
• Sistem Golden Gate memerlukan kepekatan DNA tertentu
• BioBrick assembly bahagian genetik yang standard
• Pembinaan litar genetik sintetik

Pembangunan Kit Diagnostik

Apabila membangunkan alat diagnostik molekul:

• Kloning penanda genetik spesifik penyakit
• Pembinaan plasmid kawalan positif
• Pembangunan standard kalibrasi untuk qPCR

Sistem Ekspresi Protein

Bagi para peneliti yang bekerja pada pengeluaran protein:

• Mengoptimumkan nisbah sisipan:vektor untuk vektor ekspresi salinan tinggi
• Membina sistem ekspresi yang boleh diinduksi
• Mencipta vektor rembesan untuk pemurnian protein

Aplikasi CRISPR-Cas9

Dalam aplikasi penyuntingan genom:

• Kloning RNA panduan ke dalam vektor CRISPR
• Mencipta templat penderma untuk pembaikan berarah homologi
• Membangunkan perpustakaan RNA panduan untuk saringan

Ligation yang Mencabar

Kalkulator ini sangat berharga untuk senario ligasi yang mencabar:

• Kloning sisipan besar (>5 kb)
• Pemasukan fragmen yang sangat kecil (<100 bp)
• Ligation hujung tumpul yang mempunyai kecekapan lebih rendah
• Reaksi pengumpulan pelbagai fragmen

Alternatif

Walaupun Kalkulator Ligation DNA kami memberikan pengiraan tepat untuk reaksi ligasi tradisional, beberapa pendekatan alternatif wujud untuk menyambungkan fragmen DNA:

1. Gibson Assembly: Menggunakan exonuclease, polymerase, dan ligase dalam reaksi satu tiub untuk menyambungkan fragmen DNA yang bertindih. Tiada pengiraan ligasi tradisional yang diperlukan, tetapi nisbah kepekatan masih penting.

2. Golden Gate Assembly: Menggunakan enzim pemotong Jenis IIS untuk pengumpulan arah, tanpa parut bagi pelbagai fragmen. Memerlukan jumlah yang sama bagi semua fragmen.

3. SLIC (Cloning Tanpa Ligation): Menggunakan exonuclease untuk mencipta overhang yang bertindih yang akan menyatu bersama. Biasanya menggunakan nisbah yang sama bagi fragmen.

4. In-Fusion Cloning: Sistem komersial yang membolehkan penyambungan fragmen dengan tumpang tindih 15 bp. Menggunakan nisbah tertentu berdasarkan saiz fragmen.

5. Gateway Cloning: Menggunakan recombinasi spesifik lokasi sebagai ganti ligasi. Memerlukan vektor kemasukan dan destinasi tertentu.

6. Ujian Empirikal: Beberapa makmal lebih suka menyediakan beberapa reaksi ligasi dengan nisbah sisipan:vektor yang berbeza (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) dan menentukan yang mana yang berfungsi terbaik untuk konstruk spesifik mereka.

7. Kalkulator Perisian: Pakej perisian komersial seperti Vector NTI dan SnapGene termasuk kalkulator ligasi dengan ciri tambahan seperti analisis tapak pemotongan.

Sejarah

Pembangunan pengiraan ligasi DNA selari dengan evolusi teknik kloning molekul, yang telah merevolusikan biologi molekul dan bioteknologi.

Perkembangan Awal (1970-an)

Konsep ligasi DNA untuk kloning molekul muncul pada awal 1970-an dengan kerja perintis Paul Berg, Herbert Boyer, dan Stanley Cohen, yang membangunkan molekul DNA rekombinan pertama. Dalam tempoh ini, reaksi ligasi sebahagian besarnya adalah empirikal, dengan para penyelidik menggunakan percubaan dan kesilapan untuk menentukan keadaan optimal.

Penemuan enzim pemotong dan ligase DNA menyediakan alat penting untuk memotong dan menyambung semula molekul DNA. T4 DNA ligase, yang diasingkan dari E. coli yang dijangkiti bakteriofag T4, menjadi enzim standard untuk menyambungkan fragmen DNA kerana kemampuannya untuk meligasi kedua-dua hujung tumpul dan kohesif.

Tempoh Penambahbaikan (1980-an-1990-an)

Ketika kloning molekul menjadi lebih rutin, para penyelidik mula mengembangkan pendekatan yang lebih sistematik untuk reaksi ligasi. Kepentingan nisbah molar antara DNA vektor dan sisipan menjadi jelas, yang membawa kepada pembangunan formula asas yang masih digunakan hingga hari ini.

Dalam tempoh ini, para penyelidik menetapkan bahawa DNA sisipan yang berlebihan (biasanya nisbah 3:1 hingga 5:1) secara amnya meningkatkan kecekapan ligasi untuk aplikasi kloning standard. Pengetahuan ini awalnya dikongsi melalui protokol makmal dan secara beransur-ansur memasuki manual dan buku teks biologi molekul.

Era Moden (2000-an-Hari Ini)

Kemunculan alat pengkomputeran dan kalkulator dalam talian pada 2000-an menjadikan pengiraan ligasi yang tepat lebih mudah diakses oleh para penyelidik. Ketika teknik biologi molekul menjadi lebih canggih, keperluan untuk pengiraan yang tepat menjadi lebih kritikal, terutama untuk projek kloning yang mencabar yang melibatkan pelbagai fragmen atau sisipan besar.

Hari ini, pengiraan ligasi DNA adalah bahagian integral dalam aliran kerja kloning molekul, dengan kalkulator khusus seperti ini membantu para penyelidik mengoptimumkan eksperimen mereka. Formula asas telah kekal tidak banyak berubah, walaupun pemahaman kita tentang faktor-faktor yang mempengaruhi kecekapan ligasi telah meningkat.

Kemunculan kaedah kloning alternatif seperti Gibson Assembly dan Golden Gate kloning telah memperkenalkan keperluan pengiraan baru, tetapi konsep asas nisbah molar antara fragmen DNA tetap penting di seluruh teknik ini.

Contoh Kod

Berikut adalah pelaksanaan kalkulator ligation DNA dalam pelbagai bahasa pengaturcaraan:

1' Fungsi VBA Excel untuk Kalkulator Ligation DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Kira jumlah sisipan yang diperlukan dalam ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Kira volume vektor dalam μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Kira volume sisipan dalam μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Kira volume buffer/air dalam μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Contoh penggunaan dalam sel:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Kira volume untuk reaksi ligasi DNA.
5    
6    Parameter:
7    vector_concentration (float): Kepekatan DNA vektor dalam ng/μL
8    vector_length (float): Panjang DNA vektor dalam pasangan asas
9    insert_concentration (float): Kepekatan DNA sisipan dalam ng/μL
10    insert_length (float): Panjang DNA sisipan dalam pasangan asas
11    molar_ratio (float): Nisbah molar yang diingini bagi sisipan:vektor
12    total_volume (float): Jumlah volume reaksi dalam μL
13    vector_amount (float): Jumlah DNA vektor yang ingin digunakan dalam ng (default: 50)
14    
15    Kembali:
16    dict: Kamus yang mengandungi volume dan jumlah yang dikira
17    """
18    # Kira volume vektor
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Kira jumlah sisipan yang diperlukan
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Kira volume sisipan
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Kira volume buffer/water
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Contoh penggunaan
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Sisipan: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Jumlah: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Tukar panjang kepada kb untuk pengiraan
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Kira jumlah sisipan yang diperlukan
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Kira volume
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Contoh penggunaan
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Sisipan: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Jumlah: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Tukar panjang kepada kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Kira jumlah sisipan yang diperlukan
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Kira volume
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Bulatkan kepada 2 tempat perpuluhan
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Sisipan: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Jumlah: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Tukar panjang kepada kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Kira jumlah sisipan yang diperlukan
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Kira volume
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Bulatkan kepada 2 tempat perpuluhan
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Sisipan: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Jumlah: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Soalan Lazim (FAQ)

Apakah nisbah molar yang optimal untuk ligasi DNA?

Nisbah molar optimal bagi sisipan kepada vektor biasanya berkisar antara 3:1 hingga 5:1 untuk aplikasi ligasi standard. Namun, ini boleh berbeza bergantung kepada senario ligasi tertentu:

• Untuk ligasi hujung tumpul: 3:1 hingga 5:1
• Untuk ligasi hujung melekit: 1:1 hingga 3:1
• Untuk sisipan besar (>10 kb): 1:1 hingga 2:1
• Untuk sisipan kecil (<500 bp): 5:1 hingga 10:1
• Untuk pengumpulan pelbagai fragmen: 3:1 untuk setiap sisipan kepada vektor

Mengapa reaksi ligasi saya gagal walaupun menggunakan volume yang dikira?

Beberapa faktor boleh mempengaruhi kecekapan ligasi selain daripada nisbah molar:

1. Kualiti DNA: Pastikan kedua-dua vektor dan sisipan mempunyai hujung yang bersih tanpa kerosakan
2. Dephosphorylation: Periksa sama ada vektor anda telah dephosphorylated, yang menghalang ligasi sendiri
3. Aktiviti enzim: Sahkan bahawa ligase anda aktif dan digunakan pada suhu yang betul
4. Masa inkubasi: Beberapa ligasi mendapat manfaat daripada inkubasi yang lebih lama (semalaman pada 16°C)
5. Keadaan buffer: Pastikan buffer yang betul dengan ATP digunakan
6. Pencemar: Purify DNA untuk mengeluarkan penghalang seperti EDTA atau garam tinggi

Berapa banyak DNA vektor yang harus saya gunakan dalam reaksi ligasi?

Biasanya, 50-100 ng DNA vektor disyorkan untuk reaksi ligasi standard. Menggunakan terlalu banyak vektor boleh menyebabkan latar belakang yang lebih tinggi daripada vektor yang tidak dipotong atau ligasi sendiri, sementara terlalu sedikit boleh mengurangkan kecekapan transformasi. Untuk ligasi yang mencabar, anda mungkin perlu mengoptimumkan jumlah ini.

Haruskah saya menyesuaikan pengiraan untuk ligasi hujung tumpul berbanding hujung melekit?

Ya. Ligasi hujung tumpul biasanya kurang cekap daripada ligasi hujung melekit (cohesive-end). Untuk ligasi hujung tumpul, gunakan:

• Nisbah yang lebih tinggi (3:1 hingga 5:1 atau lebih tinggi)
• Lebih banyak T4 DNA ligase (biasanya 2-3 kali lebih banyak)
• Masa inkubasi yang lebih lama
• Pertimbangkan untuk menambah PEG untuk meningkatkan kecekapan ligasi

Bagaimana saya mengira ligasi untuk pelbagai sisipan?

Untuk pengumpulan pelbagai fragmen:

1. Kira setiap jumlah sisipan secara individu menggunakan formula yang sama
2. Kekalkan jumlah nisbah molar yang sama (contohnya, untuk dua sisipan, gunakan 1.5:1.5:1 sisipan1:sisipan2:vektor)
3. Sesuaikan jumlah volume reaksi untuk menampung semua fragmen DNA
4. Pertimbangkan ligasi berturutan atau menggunakan kaedah seperti Gibson Assembly untuk pelbagai fragmen

Bolehkah saya menggunakan kalkulator ini untuk Gibson Assembly atau Golden Gate Assembly?

Kalkulator ini direka khusus untuk kloning berdasarkan enzim pemotong dan ligase tradisional. Untuk Gibson Assembly, jumlah yang sama bagi semua fragmen biasanya disyorkan (nisbah 1:1), walaupun pengiraan asas jumlah DNA berdasarkan panjang adalah serupa. Untuk Golden Gate Assembly, nisbah yang sama bagi semua komponen juga biasanya digunakan.

Bagaimana saya mengira dephosphorylation vektor dalam pengiraan saya?

Dephosphorylation vektor (mengeluarkan kumpulan fosfat 5') menghalang ligasi sendiri tetapi tidak mengubah pengiraan jumlah. Namun, untuk vektor yang telah dephosphorylated:

1. Gunakan DNA sisipan yang segar dengan fosfat 5' yang utuh
2. Pertimbangkan untuk menggunakan nisbah sisipan:vektor yang sedikit lebih tinggi (4:1 hingga 6:1)
3. Pastikan masa ligasi yang lebih lama (sekurang-kurangnya 1 jam pada suhu bilik atau semalaman pada 16°C)

Apakah jumlah minimum volume reaksi yang harus saya gunakan?

Jumlah volume reaksi praktikal minimum biasanya adalah 10 μL, yang membolehkan pencampuran yang mencukupi dan mengelakkan isu penyejatan. Jika volume DNA yang dikira melebihi jumlah volume yang diingini, anda mempunyai beberapa pilihan:

1. Gunakan sampel DNA yang lebih pekat
2. Kurangkan jumlah vektor yang digunakan (contohnya, 25 ng daripada 50 ng)
3. Tingkatkan jumlah volume reaksi
4. Pertimbangkan untuk memekatkan sampel DNA anda

Berapa lama saya harus menginkubasi reaksi ligasi saya?

Masa inkubasi yang optimal berbeza berdasarkan jenis ligasi:

• Ligasi hujung melekit: 1 jam pada suhu bilik (22-25°C) atau 4-16 jam pada 16°C
• Ligasi hujung tumpul: 2-4 jam pada suhu bilik atau semalaman (12-16 jam) pada 16°C
• Ligasi cepat (menggunakan ligase kepekatan tinggi): 5-15 minit pada suhu bilik

Bolehkah saya menggunakan semula reaksi ligasi yang tersisa untuk transformasi?

Ya, campuran ligasi biasanya boleh disimpan pada -20°C dan digunakan semula untuk transformasi. Namun, setiap kitaran beku-cair mungkin mengurangkan kecekapan. Untuk hasil terbaik:

1. Aliquot campuran ligasi sebelum pembekuan
2. Panaskan untuk mematikan ligase (65°C selama 10 minit) sebelum penyimpanan
3. Gunakan dalam 1-2 bulan untuk hasil optimal

Rujukan

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ed. ke-3). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ed. ke-4). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/