Kalkulator Ligasi DNA - Kira Nisbah Sisipan:Vektor untuk Pengklonan Molekul

Ligasi DNA ialah langkah dalam pengklonan molekul apabila fragmen sisipan dicantumkan dengan vektor plasmid oleh enzim ligase DNA T4. Kalkulator ligasi DNA mengira berapa mikroliter DNA sisipan dan DNA vektor yang perlu dicampurkan supaya tindak balas mencapai nisbah molar sisipan kepada vektor yang dipilih.

Fungsi kalkulator

Kalkulator menerima enam input: kepekatan vektor, panjang vektor, kepekatan sisipan, panjang sisipan, nisbah molar sasaran sisipan kepada vektor, dan isipadu keseluruhan tindak balas. Kalkulator juga membolehkan pengguna menetapkan jumlah DNA vektor yang hendak digunakan, dengan nilai lalai sebanyak 50 nanogram (ng). Daripada nilai-nilai ini, kalkulator mengira isipadu vektor yang perlu dipipet, isipadu sisipan yang perlu dipipet, serta jumlah penimbal atau air yang perlu ditambah untuk mencapai isipadu keseluruhan tindak balas.

Kepekatan diukur dalam nanogram per mikroliter (ng/μL), biasanya dibaca menggunakan instrumen Nanodrop atau Qubit. Panjang diukur dalam pasangan bes (bp). Satu kilobase (kb) bersamaan dengan 1000 pasangan bes. Nisbah molar menerangkan bilangan molekul sisipan yang sepatutnya ada bagi setiap satu molekul vektor. Ia bukan nisbah jisim.

Mengapa nisbah molar, bukan jisim, digunakan

Jisim DNA yang sama tidak mengandungi bilangan molekul yang sama. Sisipan pendek mempunyai berat yang lebih rendah daripada vektor panjang dengan bilangan molekul yang sama. Mencampurkan jumlah nanogram yang sama bagi sisipan pendek dan vektor panjang akan menghasilkan terlalu sedikit molekul sisipan berbanding molekul vektor. Kalkulator menskalakan jisim sisipan berdasarkan nisbah panjang fragmen, supaya campuran akhir mempunyai bilangan molekul sisipan yang dikehendaki bagi setiap molekul vektor.

Formula ligasi DNA

Jumlah DNA sisipan yang diperlukan, dalam nanogram, ialah:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

dengan $m_i$ ialah jumlah sisipan dalam nanogram, $m_v$ ialah jumlah vektor dalam nanogram, $k_i$ ialah panjang sisipan dalam kilobes, $k_v$ ialah panjang vektor dalam kilobes, dan R ialah nisbah molar sasaran sisipan kepada vektor.

Setelah jumlah itu diketahui, kalkulator menukarkan setiap jumlah kepada isipadu yang boleh dipipet:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

dengan $V_v$ dan $V_i$ ialah isipadu vektor dan sisipan dalam mikroliter, $c_v$ dan $c_i$ ialah kepekatan vektor dan sisipan dalam nanogram per mikroliter, $V_b$ ialah isipadu penimbal, dan $V_t$ ialah isipadu keseluruhan tindak balas.

Jika isipadu vektor dan sisipan digabungkan melebihi isipadu keseluruhan tindak balas, tiada ruang yang tinggal untuk penimbal, ligase atau air. Dalam keadaan itu, kalkulator melaporkan bahawa isipadu keseluruhan terlalu kecil dan bukannya memaparkan jumlah penimbal negatif.

Contoh pengiraan

Seorang penyelidik sedang memasukkan fragmen gen berukuran 1 kb ke dalam vektor plasmid berukuran 3 kb. Rancangannya adalah menggunakan 50 ng DNA vektor pada nisbah molar sisipan:vektor 3:1, dalam tindak balas berisipadu 20 μL.

Input:

• Kepekatan vektor: 50 ng/μL
• Panjang vektor: 3000 bp (3 kb)
• Kepekatan sisipan: 25 ng/μL
• Panjang sisipan: 1000 bp (1 kb)
• Nisbah molar: 3
• Isipadu keseluruhan: 20 μL
• Jumlah vektor: 50 ng

Langkah 1: jumlah sisipan

ng sisipan = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Langkah 2: isipadu

Isipadu vektor = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Isipadu sisipan = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Isipadu penimbal = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Tindak balas itu terdiri daripada 1 μL vektor, 2 μL sisipan dan 17 μL penimbal atau air, iaitu campuran yang turut ditambah dengan ligase dan penimbal tindak balasnya. Campuran ini memberikan tiga molekul sisipan bagi setiap molekul vektor.

Nisbah molar lazim untuk ligasi

Kebanyakan pengklonan standard dengan hujung melekit yang berjuntai menggunakan nisbah sisipan kepada vektor sebanyak 3:1. Ligasi yang mencantumkan hujung tumpul kurang cekap, jadi nisbah yang lebih tinggi, seperti 5:1, adalah lazim. Sisipan yang sangat besar kadangkala berfungsi lebih baik dengan nisbah yang lebih rendah, hampir kepada 1:1, kerana fragmen besar sudah menyumbangkan banyak pasangan bes bagi setiap molekul.

Soalan lazim

Apakah ligasi DNA?

Ligasi DNA ialah pencantuman dua fragmen DNA, biasanya vektor plasmid dan sisipan, menjadi satu molekul berterusan. Enzim ligase DNA T4 memeterai sambungan antara hujung fragmen tersebut.

Apakah maksud nisbah molar sisipan:vektor?

Nisbah itu ialah bilangan molekul DNA sisipan yang terdapat bagi setiap satu molekul vektor dalam tindak balas. Nisbah 3:1 bermaksud tiga molekul sisipan bagi setiap molekul vektor, tanpa mengira perbandingan jisimnya.

Mengapa tidak menggunakan jumlah nanogram vektor dan sisipan yang sama?

Fragmen DNA yang mempunyai panjang berbeza mempunyai jisim yang berbeza bagi setiap molekul. Sisipan 1 kb mempunyai berat kira-kira satu pertiga daripada vektor 3 kb bagi setiap molekul. Jumlah nanogram yang sama bagi setiap satu tidak akan menghasilkan bilangan molekul yang sama, jadi kalkulator melaraskan jisim sisipan untuk mencapai nisbah molar sasaran.

Apakah maksudnya jika isipadu keseluruhan terlalu kecil?

Ini bermaksud isipadu vektor dan sisipan sahaja sudah memenuhi keseluruhan isipadu tindak balas, sehingga tiada ruang untuk penimbal atau ligase. Penyelesaiannya adalah meningkatkan isipadu keseluruhan tindak balas atau menggunakan stok DNA yang lebih pekat.

Bolehkah kalkulator ini digunakan untuk pengklonan Gibson Assembly atau Golden Gate?

Tidak. Kaedah-kaedah tersebut menggunakan kimia tindak balas yang berbeza dan biasanya menyasarkan jumlah ekuimolar bagi semua fragmen, bukannya nisbah sisipan:vektor yang tetap. Pengiraan isipadunya berbeza daripada pengklonan ligase T4 standard.

Berapa banyak DNA vektor yang biasanya digunakan?

50 ng ialah jumlah permulaan yang lazim untuk tindak balas ligasi standard. Makmal juga menggunakan jumlah daripada 25 hingga 100 ng, yang dilaraskan mengikut kepekatan DNA dan skala tindak balas.