Kalkulator Bilangan Salinan DNA | Alat Analisis Genomik

Kalkulator Bilangan Salinan DNA

Kalkulator bilangan salinan DNA menganggarkan jumlah salinan jujukan sasaran yang terdapat dalam sampel DNA. Kalkulator ini menggunakan kepekatan dan isipadu sampel, serta kekerapan jujukan sasaran muncul dalam jujukan DNA yang lebih besar. Makmal biologi molekul menggunakan anggaran ini untuk merancang eksperimen seperti qPCR (tindak balas berantai polimerase kuantitatif) sebelum menjalankan analisis yang lebih mahal dan lebih tepat.

Maksud bilangan salinan DNA

Bilangan salinan DNA ialah bilangan kali sesuatu jujukan tertentu muncul dalam genom atau sampel. Gen manusia yang lazim muncul dua kali, sekali diwarisi daripada setiap ibu bapa. Beberapa perkara boleh mengubah bilangan itu.

• Amplifikasi: lebih daripada dua salinan. Sel kanser sering menggandakan gen yang mendorong pertumbuhan, seperti HER2 dalam sesetengah tumor payudara.
• Pemadaman: kurang daripada dua salinan, kadangkala sifar. Pemadaman boleh menyebabkan gangguan genetik.
• Duplikasi: salinan tambahan muncul di tempat yang sepatutnya hanya mempunyai satu atau dua salinan.
• Variasi bilangan salinan (CNV): perbezaan normal dalam bilangan salinan antara individu, yang ditemui merentasi bahagian genom manusia yang besar.

Formula bilangan salinan DNA

Kalkulator ini menukarkan kejadian jujukan dan jisim sampel kepada kiraan salinan menggunakan formula berikut:

$\text{Bilangan Salinan} = \frac{\text{Kejadian} \times \text{Kepekatan} \times \text{Isipadu} \times N_A}{\text{Panjang DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Dengan:

• Kejadian — bilangan kali jujukan sasaran muncul dalam keseluruhan jujukan DNA, dengan padanan bertindih dikira secara berasingan.
• Kepekatan — kepekatan DNA dalam nanogram per mikroliter (ng/μL), biasanya dibaca menggunakan spektrofotometer atau fluorometer.
• Isipadu — isipadu sampel dalam mikroliter (μL).
• $N_A$ — nombor Avogadro, 6.022 × 10²³ molekul per mol. Nombor ini menukarkan mol DNA kepada bilangan molekul.
• Panjang DNA — panjang keseluruhan jujukan DNA, dalam pasangan bes.
• 660 — berat molekul purata bagi satu pasangan bes DNA, dalam gram per mol (g/mol). Satu pasangan bes terdiri daripada dua nukleotida berpasangan, satu daripada setiap untai DNA.
• 10⁹ — menukarkan nanogram kepada gram.

Formula ini mula-mula menukarkan jisim sampel kepada mol molekul DNA, mendarabkannya dengan nombor Avogadro untuk mendapatkan jumlah molekul DNA dalam sampel, kemudian mendarabkannya dengan bilangan kali jujukan sasaran muncul dalam setiap molekul.

Alat ini hanya menerima huruf A, T, C dan G. Ruang dan pemisah baris diabaikan, dan huruf kecil dikira sama seperti huruf besar.

Cara mengira bilangan salinan DNA: contoh pengiraan

Ambil jujukan DNA sepanjang 12 pasangan bes, ATCGATCGATCG, dengan jujukan sasaran ATCG, kepekatan 10 ng/μL dan isipadu 20 μL.

Langkah 1: Kira kejadian. ATCG muncul sebanyak 3 kali dalam ATCGATCGATCG (pada kedudukan 1, 5 dan 9).

Langkah 2: Cari jumlah jisim DNA. Kepekatan × isipadu = 10 × 20 = 200 ng.

Langkah 3: Tukarkan kepada mol. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Bahagikan dengan (12 pasangan bes × 660 g/mol) = 7,920 g/mol. Hasilnya ialah 2.53 × 10⁻¹¹ mol.

Langkah 4: Tukarkan kepada bilangan molekul. Darabkan dengan nombor Avogadro: 2.53 × 10⁻¹¹ mol × 6.022 × 10²³ molekul/mol ≈ 1.52 × 10¹³ molekul DNA.

Langkah 5: Darabkan dengan kejadian. 3 × 1.52 × 10¹³ ≈ 4.56 × 10¹³, atau kira-kira 45,621,212,121,212 salinan.

Nombor ini kelihatan sangat besar kerana sampel 20 μL pada 10 ng/μL masih mengandungi trilion molekul DNA pendek. Sampel sebenar biasanya menggunakan jujukan yang jauh lebih panjang, yang mengurangkan bilangan molekul bagi jisim yang sama.

Penggunaan analisis bilangan salinan DNA

Diagnosis kanser. Makmal patologi memeriksa bilangan salinan HER2 dalam tisu tumor payudara. Sel normal membawa dua salinan. Tumor yang mengalami amplifikasi boleh membawa enam salinan atau lebih, yang mempengaruhi kelayakan untuk ubat sasaran seperti trastuzumab.

Ujian penyakit genetik. Keadaan seperti sindrom DiGeorge melibatkan pemadaman segmen kromosom. Sindrom Down melibatkan salinan tambahan kromosom 21 (trisomi 21). Pengiraan salinan membantu mengesahkan diagnosis ini.

Kuantifikasi transgen dan plasmid. Penyelidik memeriksa jumlah salinan gen yang dimasukkan ke dalam sel tumbuhan, haiwan atau bakteria. Satu salinan biasanya lebih disukai kerana salinan berganda boleh mencetuskan sel untuk menyenyapkan gen tersebut.

Pemantauan patogen dan beban virus. Anggaran bilangan salinan menjejaki jumlah DNA virus atau bakteria yang terdapat dalam sampel, dan digunakan dalam pemantauan jangkitan serta ujian alam sekitar.

Kaedah lain untuk mengukur bilangan salinan

Kalkulator ini memberikan anggaran pantas berdasarkan data jujukan dan kepekatan. Makmal yang memerlukan ketepatan lebih tinggi biasanya menggunakan salah satu kaedah berikut:

• PCR kuantitatif (qPCR): menggandakan dan mengukur DNA dalam masa nyata; ketepatannya kira-kira 15–20% dengan lengkung piawai yang baik.
• PCR digital (dPCR): membahagikan sampel kepada ribuan tindak balas kecil untuk pengiraan langsung, tanpa memerlukan lengkung piawai.
• Hibridisasi in situ berpendarfluor (FISH): mengira jujukan secara visual di bawah mikroskop secara langsung pada sel atau kromosom; kaedah piawai dalam banyak makmal diagnosis kanser.
• Penjujukan generasi seterusnya (NGS): melakukan penjujukan terhadap keseluruhan sampel dan memprofilkan bilangan salinan merentasi genom pada masa yang sama.

Soalan lazim

Apakah bilangan salinan DNA? Ia ialah bilangan kali sesuatu jujukan DNA muncul dalam genom atau sampel. Kebanyakan gen manusia muncul dua kali, sekali daripada setiap ibu bapa. Salinan tambahan atau salinan yang hilang boleh mempengaruhi kesihatan dan risiko penyakit.

Sejauh manakah ketepatan kalkulator ini? Kalkulator ini memberikan anggaran teori berdasarkan input yang diberikan, bukan ukuran makmal. Ketepatan bergantung pada ketepatan pengukuran kepekatan dan tahap kekhususan jujukan sasaran. Kaedah seperti PCR digital lebih tepat untuk hasil yang diterbitkan.

Bolehkah kalkulator ini digunakan untuk RNA? Tidak. RNA menggunakan urasil dan bukannya timina serta gula yang berbeza, jadi berat molekulnya berbeza daripada DNA. RNA mempunyai berat molekul purata kira-kira 330 g/mol bagi setiap nukleotida, berbanding kira-kira 660 g/mol bagi setiap pasangan bes DNA. Penggunaan formula DNA pada data RNA akan memberikan jawapan yang salah.

Mengapakah jujukan bertindih dikira lebih daripada sekali? Kalkulator ini mengira setiap kedudukan yang sepadan dengan sasaran, walaupun padanan berkongsi huruf. Dalam ATATAT, jujukan ATA sepadan dua kali, pada kedudukan 1 dan kedudukan 3, kerana setiap kedudukan permulaan diperiksa secara berasingan.

Apakah julat kepekatan DNA yang paling sesuai? Kepekatan 10–100 ng/μL memberikan bacaan paling boleh dipercayai pada instrumen makmal piawai. Di bawah 10 ng/μL, ralat pengukuran meningkat, dan kaedah yang lebih sensitif seperti fluorometer disyorkan berbanding spektrofotometer piawai.

Bolehkah kalkulator ini menganggarkan bilangan salinan plasmid? Ya. Masukkan keseluruhan jujukan plasmid sebagai jujukan DNA dan rantau unik sisipan sebagai jujukan sasaran, bersama-sama kepekatan plasmid dan isipadu sampel yang diukur.