Kalkulator Kelarutan Protein - Alat pH & Suhu Percuma

Kalkulator kelarutan protein menganggarkan kepekatan tertinggi protein yang kekal terlarut dalam pelarut pada pH, suhu dan kekuatan ion tertentu. Kalkulator ini menukarkan kimia asas kepada satu nombor, iaitu miligram protein bagi setiap mililiter pelarut.

Kelarutan protein penting dalam biokimia, formulasi ubat dan sains makanan. Protein yang tidak kekal terlarut akan membentuk agregat atau mendakan, yang boleh merosakkan eksperimen atau menyebabkan ubat tidak dapat disuntik.

Cara mengira kelarutan protein

Kelarutan bergantung pada lima faktor: titik isoelektrik protein (pH pada ketika cas bersihnya sifar), takat leburnya (suhu apabila protein mula mengalami pengungkapan struktur), pemalar dielektrik pelarut (ukuran sejauh mana pelarut memisahkan zarah bercas), pH larutan dan kekuatan ion (ukuran jumlah garam terlarut yang hadir).

Kalkulator bermula dengan kelarutan setiap protein yang diketahui dalam air pada keadaan rujukan: 25 °C, pH 7.0 dan kekuatan ion 0.15 M (kira-kira aras garam dalam darah). Kemudian, nilai rujukan itu didarabkan dengan empat nisbah, satu bagi setiap keadaan yang berubah.

Formula kelarutan protein

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ ialah kelarutan protein yang diketahui dalam air pada keadaan rujukan, dalam mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, dengan $pI$ ialah titik isoelektrik protein. Kelarutan paling rendah pada titik isoelektrik dan meningkat apabila pH bergerak menjauhinya, sebelum mendatar dalam lingkungan beberapa unit pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, dengan $I$ ialah kekuatan ion dalam mol per liter. Pada aras garam rendah, istilah ini sedikit meningkatkan kelarutan (“salting-in”). Pada aras garam tinggi, istilah ini mengurangkan kelarutan (“salting-out”).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, dengan $T_m$ ialah takat lebur protein dalam °C. Kelarutan meningkat perlahan-lahan dengan suhu, kemudian menurun dengan mendadak apabila suhu menghampiri $T_m$ dan protein mula terbuka lipatannya.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, dengan $\varepsilon$ ialah pemalar dielektrik pelarut. Air mempunyai pemalar dielektrik 78.4, jadi istilah ini bersamaan dengan 1 dalam air. Pelarut yang memisahkan cas dengan kurang berkesan berbanding air, seperti etanol, mengurangkan kelarutan.

Nilai rujukan yang digunakan oleh kalkulator

Kategori kelarutan

Contoh: albumin dalam penimbal fosfat

Cari kelarutan albumin dalam penimbal fosfat pada 25 °C, pH 7.4 dan kekuatan ion 0.15 M.

Nilai rujukan albumin ialah $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL dan $T_m = 63°C$. Penimbal fosfat mempunyai pemalar dielektrik 76.0.

1. Istilah pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Nisbah: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Istilah ion: kekuatan ion (0.15 M) sama dengan nilai rujukan, jadi nisbahnya ialah 1.
3. Istilah suhu: suhu (25 °C) sama dengan nilai rujukan, jadi nisbahnya ialah 1.
4. Istilah pelarut: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Kalkulator melaporkan 492.12 mg/mL, yang tergolong dalam kategori “sangat larut”.

Contoh: lisozim dalam gliserol pada suhu rendah

Cari kelarutan lisozim dalam larutan gliserol pada 4 °C, pH 5.0 dan kekuatan ion 0.1 M. Keadaan ini serupa dengan penyimpanan enzim dalam keadaan sejuk.

Nilai rujukan lisozim ialah $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL dan $T_m = 72°C$. Gliserol mempunyai pemalar dielektrik 42.5.

1. Istilah pH: perubahan daripada pH 7.0 kepada pH 5.0 (kedua-duanya jauh di bawah pI 11.35) hanya mengubah sedikit istilah pH. Nisbah: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Istilah ion: pengurangan kekuatan ion daripada 0.15 M kepada 0.1 M meningkatkan sedikit kelarutan melalui kesan salting-in. Nisbah: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Terma suhu: penyejukan daripada 25 °C kepada 4 °C, jauh di bawah takat lebur, mengurangkan terma tersebut. Nisbah: 0.8106.
4. Istilah pelarut: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Kalkulator melaporkan 35.88 mg/mL, yang tergolong dalam kategori “larut”. Pemalar dielektrik gliserol yang rendah, bukannya suhu sejuk, menyebabkan keputusan menurun daripada nilai rujukan.

Cara menggunakan kalkulator kelarutan protein

1. Pilih protein daripada senarai: albumin, insulin, lisozim, hemoglobin, mioglobin, kolagen, kasein atau fibrinogen.
2. Pilih pelarut: air, penimbal fosfat, penimbal Tris, gliserol, DMSO, metanol, etanol atau aseton.
3. Masukkan suhu dalam °C (0 hingga 100), pH (0 hingga 14) dan kekuatan ion dalam molar (0 hingga 2).
4. Baca kelarutan yang dikira dalam mg/mL dan kategorinya. Bar di bawah keputusan menunjukkan nilai pada skala 0 hingga 100 mg/mL dan terisi sepenuhnya pada 100 mg/mL atau lebih.

Faktor yang mempengaruhi kelarutan protein

pH dan titik isoelektrik. Setiap protein mempunyai titik isoelektrik, iaitu pH apabila permukaannya tidak membawa cas elektrik bersih. Pada pH itu, molekul protein tidak saling menolak, lalu bergumpal dan lebih mudah mendak keluar daripada larutan. Mengalihkan pH daripada titik isoelektrik, dalam mana-mana arah, memberikan protein cas bersih. Molekul bercas saling menolak, lalu kekal berasingan dan terlarut.

Kekuatan ion. Ion garam terlarut mengelilingi kumpulan bercas pada permukaan protein. Pada kepekatan rendah hingga sederhana, ion ini melindungi cas yang sebaliknya akan menarik dua molekul protein supaya bersatu, lalu meningkatkan kelarutan. Kesan ini dipanggil salting-in. Pada kepekatan garam tinggi, ion bersaing dengan protein untuk mengikat molekul air, lalu menanggalkan lapisan air yang mengekalkan protein dalam keadaan terlarut. Proses ini dipanggil penggaraman keluar dan menjadi asas kepada kaedah penulenan yang lazim, yang menggunakan ammonium sulfat untuk mendakkan protein daripada campuran.

Suhu. Pemanasan larutan secara umum meningkatkan kelarutan sehingga tahap tertentu. Apabila suhu menghampiri takat lebur protein, protein mula terbuka lipatannya. Proses pembukaan lipatan ini mendedahkan bahagian hidrofobik (yang menolak air) dalam protein, yang biasanya tersembunyi di dalam struktur terlipatnya. Bahagian yang terdedah ini melekat antara satu sama lain dan menyebabkan pengagregatan, lalu kelarutan menurun dengan mendadak berhampiran dan melebihi takat lebur.

Pelarut. Pemalar dielektrik pelarut mengukur sejauh mana pelarut melemahkan tarikan elektrik antara zarah bercas. Air mempunyai pemalar dielektrik yang tinggi dan memisahkan cas dengan baik, sebab itu kebanyakan protein lebih mudah larut dalam air berbanding pelarut organik seperti etanol atau aseton. Pelarut dengan pemalar dielektrik rendah membolehkan cas bertentangan pada molekul protein yang berbeza saling menarik dengan lebih kuat, lalu menggalakkan pengagregatan.

Had

Kalkulator ini menggunakan model dipermudah yang dibina berdasarkan sebilangan kecil protein rujukan dan pelarut piawai. Model ini tidak mengambil kira ketulenan protein, bahan tambahan seperti detergen atau penstabil, atau komponen penimbal yang luar biasa. Keputusan ialah anggaran untuk merancang eksperimen, bukan pengganti untuk mengukur kelarutan secara langsung di makmal.

Soalan lazim

Apakah kelarutan protein? Kelarutan protein ialah kepekatan maksimum protein yang kekal terlarut sepenuhnya dalam pelarut tanpa membentuk agregat atau mendakan yang kelihatan.

Mengapakah protein paling kurang larut pada titik isoelektriknya? Pada titik isoelektrik, protein tidak membawa cas elektrik bersih, jadi molekul protein tidak lagi saling menolak secara elektrik. Tanpa tolakan itu, molekul lebih cenderung melekat antara satu sama lain dan mendak daripada larutan.

Apakah perbezaan antara penggaraman masuk dengan penggaraman keluar? Penggaraman masuk berlaku pada kepekatan garam rendah, apabila ion terlarut melindungi kumpulan protein yang bercas daripada satu sama lain dan meningkatkan kelarutan. Penggaraman keluar berlaku pada kepekatan garam tinggi, apabila ion menanggalkan air daripada permukaan protein dan mengurangkan kelarutan.

Adakah suhu yang lebih tinggi sentiasa meningkatkan kelarutan? Tidak. Kelarutan cenderung meningkat dengan suhu hanya sehingga tahap tertentu. Apabila suhu menghampiri takat lebur protein, protein mula kehilangan struktur lipatannya, yang biasanya menyebabkan pengagregatan dan penurunan kelarutan yang mendadak.

Mengapakah protein kurang larut dalam etanol atau aseton berbanding dalam air? Air mempunyai pemalar dielektrik yang tinggi, bermakna air melemahkan tarikan elektrik antara bahagian molekul protein yang bercas dengan sangat berkesan. Etanol dan aseton mempunyai pemalar dielektrik yang lebih rendah, jadi kumpulan bercas pada molekul protein yang berbeza saling menarik dengan lebih kuat dalam pelarut ini, lalu pengagregatan menjadi lebih berkemungkinan.

Sejauh manakah ketepatan kalkulator ini? Kalkulator ini memberikan anggaran berdasarkan model fizikal dan set kecil protein serta pelarut rujukan. Ia berguna untuk mengecilkan julat keadaan yang perlu diuji, tetapi pengukuran eksperimen tetap satu-satunya cara untuk mengesahkan kelarutan sampel protein tertentu.

Bacaan lanjut

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mekanisme salting-in dan salting-out protein oleh garam kation dwivalen. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Mengukur dan meningkatkan kelarutan protein. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Protein, Asid Amino dan Peptida sebagai Ion dan Ion Dwikutub. Reinhold Publishing.