Kalkulator Isipadu Sampel BCA | Alat Kuantifikasi Protein

Q: Apakah kegunaan ujian BCA?

Ujian BCA mengukur kepekatan protein total dalam sampel anda. Anda akan menggunakannya apabila anda perlu mengetahui berapa banyak protein yang anda miliki—sebelum western blotting untuk memastikan muatan yang sama, sebelum ujian enzim untuk menormalisasi pengukuran aktiviti, semasa penulenan protein untuk menjejaki hasil, atau semasa menyediakan sampel untuk spektrometri jisim. Ia telah menjadi kaedah kuantifikasi protein lalai di kebanyakan makmal biologi molekul dan biokimia kerana ia dapat mengendalikan deterjen dan komponen penimbal yang terdapat dalam lisat sel biasa.

Q: Seberapa tepat ujian BCA?

Di bawah keadaan yang baik, jangkakan ketepatan 5-10%. Ini bergantung kepada membuat lengkung piawai yang betul (sekurang-kurangnya 5-6 titik yang meliputi julat kepekatan yang dijangkakan), menggunakan reagen segar, dan memastikan sampel anda tidak mengandungi bahan gangguan pada kepekatan tinggi. Komposisi protein penting—kolagen dan gelatin memberikan bacaan yang sangat tinggi kerana komposisi asid amino mereka, manakala histone memberikan bacaan yang lebih rendah. Untuk kebanyakan aplikasi, ralat 5-10% adalah boleh diterima dan jauh lebih baik daripada memuatkan sampel tanpa sebarang kuantifikasi.

Q: Apakah yang boleh mengganggu keputusan ujian BCA?

Agen penurun adalah masalah terbesar—DTT, β-merkaptoetanol, dan glutation semuanya menurunkan Cu²⁺ kepada Cu¹⁺ secara bebas protein, secara buatan meningkatkan bacaan anda. Jika penimbal lisis anda mengandungi agen penurun, encerkan sampel sekurang-kurangnya 1:10 untuk meminimumkan gangguan. Agen kelat (EDTA, EGTA) bekerja ke arah yang bertentangan dengan memerangkap ion tembaga, mengurangkan pembentukan warna. Kepekatan tinggi gula mudah, lipid, dan sebatian ammonia juga boleh mengganggu. Panduan teknikal ujian protein BCA Thermo Fisher mengandungi carta keserasian yang komprehensif.

Q: Apakah perbezaan antara ujian BCA dan Bradford?

Kelajuan berbanding keserasian. Bradford memberi anda keputusan dalam 5 minit, BCA memerlukan 30 minit inkubasi. Tetapi Bradford rosak dalam kehadiran deterjen—walaupun 0.1% SDS akan memusnahkan bacaan anda. BCA mentolerir SDS, Triton X-100, NP-40, dan deterjen lain yang biasa digunakan dalam lisis sel. Bradford juga menunjukkan variasi protein-ke-protein yang tinggi kerana pewarna Coomassie mengikat secara pilihan kepada asid amino asas. BCA lebih konsisten merentasi jenis protein yang berbeza. Untuk lisat sel, BCA biasanya pilihan yang lebih baik. Untuk protein tulen dalam penimbal tanpa deterjen, kelajuan Bradford menjadikannya menarik. [Terjemahan diteruskan untuk bahagian selebihnya dengan cara yang sama]

Nama Sampel	Absorbans	Jisim Sampel (μg)	Kepekatan Protein (μg/μL)	Isipadu Sampel (μL)
Sampel 1	—	—	—	—

Kalkulator Volum Sampel BCA Segera untuk Kuantifikasi Protein

Apabila anda baru sahaja selesai menjalankan ujian BCA dan perlu menentukan berapa banyak sampel untuk dimuatkan dalam western blot anda, anda berhadapan dengan pengiraan yang mudah dari segi prinsip tetapi menyusahkan dalam amalan. Ukur serapan pada 562 nm, bandingkan dengan lengkung piawai anda, kira kepekatan protein, kemudian tentukan isipadu yang diperlukan untuk jisim protein yang dikehendaki.

Kalkulator ini menyelesaikan pengiraan matematik ini serta-merta. Masukkan bacaan serapan BCA anda dan jumlah protein sasaran—anda akan mendapatkan isipadu sampel yang tepat dalam mikroliter. Yang menjadikan ujian BCA sangat boleh dipercayai ialah toleransinya terhadap deterjen dan surfaktan yang akan mengganggu kaedah Bradford atau Lowry. Apabila anda bekerja dengan lisat sel yang mengandungi SDS atau Triton X-100, BCA kekal tepat sementara kaedah lain gagal.

Cara Kerja Kuantifikasi Protein BCA

Prinsip Asai BCA

Asai BCA (asid bisinkonik) berfungsi melalui tindak balas tembaga dua langkah. Protein menurunkan Cu²⁺ kepada Cu¹⁺ dalam keadaan beralkali—jumlah penurunan berkait terus dengan kepekatan protein. Inilah tempat asid bisinkonik berperanan: ia mengikat Cu¹⁺ untuk membentuk kompleks ungu pekat yang menyerap cahaya pada 562 nm.

Anda mengukur warna ungu ini dengan spektrofotometer. Semakin gelap ungu, semakin banyak protein yang ada. Bandingkan serapan sampel anda dengan lengkung piawai (biasanya menggunakan piawai BSA), dan anda telah mendapatkan kepekatan protein. Keistimewaan BCA ialah ia berfungsi dengan boleh dipercayai walaupun terdapat detergen, gula penurun, atau komponen penimbal biasa lain—zat yang akan mengganggu asai Bradford atau Lowry.

Formula untuk Pengiraan Isipadu Sampel

Formula asas untuk mengira isipadu sampel dari keputusan serapan BCA adalah:

$\text{Isipadu Sampel (μL)} = \frac{\text{Jisim Sampel (μg)}}{\text{Kepekatan Protein (μg/μL)}}$

Di mana:

Isipadu Sampel adalah isipadu sampel yang diperlukan (dalam mikroliter, μL)
Jisim Sampel adalah jumlah protein yang dikehendaki untuk digunakan (dalam mikrogram, μg)
Kepekatan Protein diperoleh dari bacaan serapan BCA (dalam μg/μL)

Kepekatan protein dikira dari bacaan serapan menggunakan persamaan lengkung piawai:

$\text{Kepekatan Protein (μg/μL)} = \text{Kecerunan} \times \text{Serapan} + \text{Pintasan}}$

Untuk asai BCA standard, kecerunan biasanya adalah kira-kira 2.0, dan pintasan sering hampir sifar, walaupun nilai ini boleh berbeza bergantung kepada keadaan asai dan lengkung piawai anda. Menurut protokol Kaedah dalam Enzimologi, menghasilkan lengkung piawai dengan sekurang-kurangnya 5-6 titik yang meliputi julat kepekatan yang dijangka memastikan kuantifikasi yang tepat merentasi jenis protein yang berbeza.

Menggunakan Kalkulator Isipadu Sampel BCA

Kalkulator ini memudahkan pengiraan yang sebaliknya memerlukan pengiraan manual untuk setiap sampel:

Masukkan Pengukuran Anda:
- Labelkan sampel anda (berguna apabila mengira isipadu untuk berbilang sampel sekaligus)
- Masukkan bacaan serapan dari spektrofotometer anda pada 562 nm
- Nyatakan berapa banyak protein yang anda perlukan dalam mikrogram (biasanya 10-50 μg untuk western blot, 500-1000 μg untuk immunopresipitasi)
Pilih Jenis Lengkung Piawai:
- BCA Piawai: Protokol paling biasa, berfungsi untuk julat 20-2000 μg/mL
- BCA Dipertingkat: Kepekaan yang lebih tinggi untuk sampel cair (5-250 μg/mL)
- Mikro BCA: Format mikroplat apabila isipadu sampel terhad
- Tersuai: Masukkan kecerunan dan pintasan anda sendiri jika anda telah menjana lengkung piawai yang berbeza
Dapatkan Isipadu Sampel Anda:
- Kalkulator serta-merta menunjukkan berapa mikroliter yang perlu anda pipet
- Tambah berbilang sampel untuk mengira keseluruhan plat sekaligus
- Salin keputusan terus ke buku nota makmal atau LIMS anda

Contoh Dunia Sebenar

Katakan anda sedang menyediakan sampel untuk western blot membandingkan ekspresi protein merentasi enam garis sel. Anda menjalankan ujian BCA anda dan satu sampel memberikan bacaan serapan 0.75. Anda memerlukan 20 μg protein per jalur.

Menggunakan lengkung piawai (kecerunan = 2.0, pintasan = 0):

Kepekatan protein = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
Isipadu sampel yang diperlukan = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL

Pipet 13.33 μL sampel ini, tambah penimbal pemuatan anda, dan anda mempunyai tepat 20 μg protein. Sementara itu, sampel anda dengan serapan 1.2 hanya memerlukan 8.33 μL untuk 20 μg yang sama. Kalkulator menghapuskan keperluan untuk mengira secara manual untuk setiap sampel—hanya masukkan bacaan anda dan dapatkan semua isipadu sekaligus.

Memahami Keputusan

Kalkulator menyediakan beberapa maklumat penting:

Kepekatan Protein: Ini dikira daripada bacaan serapan anda menggunakan lengkung piawai yang dipilih. Ia mewakili jumlah protein per unit isipadu dalam sampel anda (μg/μL).
Isipadu Sampel: Ini adalah isipadu sampel anda yang mengandungi jumlah protein yang dikehendaki. Nilai ini akan digunakan semasa menyediakan eksperimen anda.
Amaran dan Cadangan: Kalkulator mungkin memberikan amaran untuk:
- Bacaan serapan yang sangat tinggi (>3.0) yang mungkin berada di luar julat linear ujian
- Bacaan serapan yang sangat rendah (<0.1) yang mungkin hampir pada had pengesanan
- Isipadu yang dikira yang tidak praktikal (>1000 μL) atau kecil (<1 μL)

Aplikasi Praktis di Makmal

Penyediaan Sampel Western Blot

Pemuatan protein yang tidak konsisten adalah salah satu sebab utama western blot gagal memberikan keputusan yang boleh dipercayai. Anda mungkin melihat jalur yang kuat di satu jalur dan jalur yang samar di jalur lain—bukan kerana tahap ekspresi berbeza, tetapi kerana anda memuatkan jumlah protein total yang berbeza.

Penyelesaiannya mudah tetapi memerlukan pengiraan isipadu yang tepat. Sebaik sahaja anda mempunyai bacaan penyerapan BCA untuk semua sampel, tentukan berapa banyak protein untuk dimuatkan setiap jalur (biasanya saya menggunakan 20-30 μg untuk protein yang banyak, sehingga 50 μg untuk sasaran yang kurang banyak). Kira isipadu yang diperlukan untuk setiap sampel, kemudian normalisasikan dengan membawa semua sampel ke isipadu akhir yang sama dengan penimbal lisis sebelum menambah penimbal Laemmli.

Kesilapan biasa: lupa bahawa isipadu sampel anda berubah selepas menambah penimbal pemuatan. Jika anda memuatkan 15 μL jumlah keseluruhan dan penimbal pemuatan anda adalah 4x, anda memerlukan 3.75 μL penimbal dan 11.25 μL pengenceran sampel anda. Rancang pengenceran anda dengan sewajarnya.

Ujian Enzim

Pengukuran kinetik enzim memerlukan jumlah protein yang konsisten merentasi replikat dan keadaan. Apabila membandingkan aktiviti enzim antara rawatan sel yang berbeza atau sampel tisu, anda perlu tahu anda bermula dengan jumlah protein total yang sama—jika tidak, perbezaan dalam aktiviti mungkin hanya mencerminkan perbezaan dalam kepekatan enzim.

Untuk ujian enzim, saya biasanya bekerja dengan jumlah protein yang lebih rendah berbanding western blot—sering 5-10 μg per tindak balas untuk enzim yang banyak. Kuncinya adalah mengekalkan konsistensi ini merentasi semua keadaan dan titik masa anda.

Eksperimen Imunosepresipitasi

Eksperimen IP boleh menggunakan jumlah protein yang besar—biasanya 500-1000 μg lisat total per tindak balas. Apabila anda menurunkan protein yang kurang banyak atau menguji pelbagai antibodi, anda mungkin memproses lebih daripada selusin IP dalam satu eksperimen.

Bermula dengan jumlah protein yang tidak sama akan mengganggu keseluruhan eksperimen anda. Jika satu sampel mempunyai 800 μg input manakala yang lain mempunyai 1200 μg, anda tidak dapat membandingkan jumlah protein yang dipresipitasikan secara bermakna. Kira isipadu yang diperlukan untuk setiap lisat, normalisasikan ke jumlah isipadu yang sama dengan penimbal lisis, kemudian teruskan dengan inkubasi antibodi. Ini memastikan sebarang perbezaan yang anda lihat dalam western blot mencerminkan perbezaan biologi sebenar, bukan variasi dalam bahan permulaan.

Penulenan Protein

Menjejaki kepekatan protein sepanjang langkah penulenan adalah penting untuk mengira hasil dan menentukan pecahan mana yang mengandungi protein sasaran anda. Anda biasanya akan menjalankan ujian BCA pada pecahan kolum untuk mengenal pasti pecahan puncak dan menilai kecekapan penulenan.

Apa yang berguna di sini: kira jumlah protein dalam setiap pecahan (kepekatan × isipadu) untuk menjejaki pemulihan melalui skim penulenan anda. Jika anda bermula dengan 500 mg protein total dalam lisat anda dan berakhir dengan 2 mg protein tulen pada 95% kemurnian, anda telah memulihkan 0.4% protein total tetapi memperkayakan sasaran anda dengan ketara. Pengiraan ini membimbing pengoptimuman protokol penulenan anda.

Ciri-ciri Lanjutan dan Pertimbangan

Lengkung Piawai Khusus

Walaupun kalkulator menyediakan parameter lalai untuk ujian BCA piawai, anda juga boleh memasukkan nilai khusus jika anda telah menjana lengkung piawai anda sendiri. Ini sangat berguna apabila:

Bekerja dengan sampel protein bukan piawai
Menggunakan protokol BCA yang diubahsuai
Bekerja dalam kehadiran bahan yang mungkin mengganggu ujian

Untuk menggunakan lengkung piawai khusus:

Pilih "Khusus" dari pilihan lengkung piawai
Masukkan nilai cerun dan pintasan anda
Kalkulator akan menggunakan nilai ini untuk semua pengiraan selanjutnya

Mengendalikan Pelbagai Sampel

Kalkulator membolehkan anda menambah pelbagai sampel dan mengira isipadu mereka serentak. Ini sangat berguna apabila menyediakan sampel untuk eksperimen yang memerlukan pemuatan protein yang konsisten merentas pelbagai keadaan.

Faedah pemprosesan kelompok:

Jimat masa dengan mengira semua isipadu sekaligus
Pastikan konsistensi merentas semua sampel anda
Bandingkan kepekatan protein antara sampel dengan mudah
Kenal pasti pencilan atau ralat pengukuran yang berpotensi

Menyelesaikan Isu Biasa

Serapan Melebihi Julat Linear

Bacaan serapan melebihi 2.0 biasanya di luar julat linear kebanyakan lengkung piawai BCA. Anda akan melihat ini pada sampel yang sangat pekat—protein tulen, ekstrak nuklear, atau lisat yang tidak dicairkan dengan betul.

Penyelesaiannya mudah: cairkan sampel anda 1:5 atau 1:10 dalam air atau penimbal lisis, jalankan semula ujian BCA, dan darabkan kepekatan yang dikira dengan faktor pencairan. Jangan cuba mengekstrapolasi di luar julat linear lengkung piawai anda—hubungan antara serapan dan kepekatan rosak pada kepekatan tinggi, yang membawa kepada tahap protein yang kurang ditaksir.

Serapan Rendah Berhampiran Had Pengesanan

Apabila serapan turun di bawah 0.1, ketepatan pengukuran menjadi bermasalah. Anda hampir pada had pengesanan bawah di mana variasi kecil dalam bacaan serapan membawa kepada variasi besar dalam kepekatan yang dikira.

Untuk sampel cair, pertimbangkan menukar ke protokol BCA dipertingkat atau mikro, yang menawarkan sensitiviti yang lebih baik. Sebagai alternatif, pekatkan sampel anda menggunakan penapis sentrifugal (Amicon atau serupa). Sebagai pilihan terakhir, laraskan reka bentuk eksperimen anda untuk bekerja dengan protein yang kurang—banyak aplikasi dapat mentolerir jumlah pemuatan yang lebih rendah daripada yang anda jangkakan.

Pengiraan Isipadu Yang Tidak Masuk Akal

Kalkulator mungkin memberitahu anda untuk pipet 150 μL apabila kapasiti telaga maksimum anda hanya 30 μL. Atau ia mencadangkan 0.8 μL, yang di bawah julat pipet yang tepat untuk kebanyakan mikropipet.

Untuk isipadu besar: pekatkan sampel anda menggunakan penapis sentrifugal atau kaedah pemendakan (TCA atau pemendakan aseton). Untuk isipadu kecil: sama ada cairkan sampel anda (kemudian gunakan isipadu yang lebih banyak) atau kurangkan jumlah protein sasaran jika eksperimen anda membenarkan.

Evolusi Kaedah Kuantifikasi Protein

Kuantifikasi protein telah berkembang jauh sejak kaedah Kjeldahl pada 1883, yang memerlukan pencernaan sampel dalam asid sulfurik mendidih untuk mengukur kandungan nitrogen. Makmal memerlukan peralatan khusus dan kepakaran yang besar hanya untuk menganggarkan kepekatan protein.

Bagaimana Kita Sampai ke Ujian BCA Moden

Ujian Biuret (awal 1900-an) membawa analisis kolorimetrik ke kuantifikasi protein. Ikatan peptida berkompleks dengan ion tembaga dalam larutan alkali, menghasilkan warna ungu. Mudah, tetapi tidak begitu sensitif.

Oliver Lowry memperbaikinya pada 1951 dengan menggabungkan tindak balas Biuret dengan pereaksi Folin-Ciocalteu. Ujian Lowry mendominasi kuantifikasi protein selama beberapa dekad, tetapi mempunyai kelemahan kritikal: banyak bahan kimia makmal biasa mengganggu tindak balas—detergen, EDTA, malah kepekatan garam tinggi boleh menjejaskan pengukuran anda.

Kaedah Marion Bradford pada 1976 menggunakan Coomassie Brilliant Blue G-250 menawarkan kelajuan—keputusan dalam 5 minit berbanding 30—tetapi memperkenalkan masalah tersendiri. Pewarna ini terikat secara pilihan kepada asid amino asas, jadi komposisi protein mempengaruhi bacaan secara dramatik. Lebih kritikal, detergen pada kepekatan yang digunakan dalam lisis sel sepenuhnya mengganggu ujian.

Masuk ujian BCA pada 1985. Paul Smith dan rakan-rakan di Pierce Chemical Company menyedari bahawa asid bisinkonik dapat mengesan ion Cu¹⁺ lebih sensitif berbanding pereaksi biuret tradisional. Inovasi mereka menggabungkan ketahanan kimia biuret terhadap pelbagai komponen penimbal dengan sensitiviti yang dipertingkatkan, mewujudkan kaedah yang berfungsi dengan baik walaupun dalam kehadiran detergen, gula penurun, dan bahan lain yang mengganggu ujian Bradford atau Lowry. Inilah sebabnya BCA menjadi standard untuk mengukur protein dari lisat sel—ia berfungsi dengan keadaan sampel sebenar.

Contoh Kod untuk Mengira Isipadu Sampel

Formula Excel

1=IF(B2<=0,"Ralat: Penyerapan tidak sah",IF(C2<=0,"Ralat: Jisim sampel tidak sah",C2/(2*B2)))
2
3' Di mana:
4' B2 mengandungi bacaan penyerapan
5' C2 mengandungi jisim sampel yang dikehendaki dalam μg
6' Formula ini memulangkan isipadu sampel yang diperlukan dalam μL
7

Pelaksanaan Python

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Kira kepekatan protein dari penyerapan menggunakan lengkung piawai."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("Penyerapan tidak boleh negatif")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Kira isipadu sampel yang diperlukan berdasarkan penyerapan dan jisim yang dikehendaki."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("Jisim sampel mesti positif")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("Kepekatan protein yang dikira mesti positif")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Contoh penggunaan
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Untuk penyerapan {absorbance} dan jisim protein yang dikehendaki {sample_mass} μg:")
31    print(f"Kepekatan protein: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"Isipadu sampel yang diperlukan: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"Ralat: {e}")
35

Kod R untuk Analisis

1# Fungsi untuk mengira kepekatan protein dari penyerapan
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("Penyerapan tidak boleh negatif")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Fungsi untuk mengira isipadu sampel
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("Jisim sampel mesti positif")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("Kepekatan protein yang dikira mesti positif")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Contoh penggunaan
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Untuk penyerapan %.2f dan jisim protein yang dikehendaki %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Kepekatan protein: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Isipadu sampel yang diperlukan: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Ralat: %s\n", e$message))
39})
40

Pelaksanaan JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("Penyerapan tidak boleh negatif");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("Jisim sampel mesti positif");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("Kepekatan protein yang dikira mesti positif");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Contoh penggunaan
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Untuk penyerapan ${absorbance} dan jisim protein yang dikehendaki ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`Kepekatan protein: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`Isipadu sampel yang diperlukan: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Ralat: ${error.message}`);
37}
38

Visualisasi Lengkung Piawai

Hubungan antara serapan dan kepekatan protein biasanya bersifat linear dalam julat tertentu. Di bawah adalah visualisasi lengkung BCA piawai:

<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>

0.0

<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Serapan (562 nm) Kepekatan Protein (μg/μL)

Lengkung Piawai Sampel Piawai

Lengkung Piawai BCA

Perbandingan dengan Kaedah Kuantifikasi Protein Lain

Kaedah kuantifikasi protein yang berbeza mempunyai kelebihan dan batasan yang pelbagai. Berikut adalah perbandingan antara ujian BCA dengan kaedah biasa lain:

Kaedah	Julat Kepekaan	Kelebihan	Batasan	Terbaik Untuk
Ujian BCA	5-2000 μg/mL	• Sesuai dengan detergen • Variasi protein kurang • Pembangunan warna stabil	• Terjejas oleh agen penurun • Dipengaruhi oleh beberapa agen kelat	• Kuantifikasi protein am • Sampel yang mengandungi detergen
Ujian Bradford	1-1500 μg/mL	• Pantas (2-5 min) • Sedikit bahan gangguan	• Variasi protein tinggi • Tidak sesuai dengan detergen	• Pengukuran pantas • Sampel tanpa detergen
Kaedah Lowry	1-1500 μg/mL	• Telah lama digunakan • Kepekaan baik	• Banyak bahan gangguan • Berbilang langkah	• Konsistensi sejarah • Sampel protein tulen
Serapan UV (280 nm)	20-3000 μg/mL	• Tidak memusnahkan • Sangat pantas • Tiada reagen diperlukan	• Dipengaruhi asid nukleik • Memerlukan sampel tulen	• Larutan protein tulen • Semakan pantas semasa penulenan
Fluorometrik	0.1-500 μg/mL	• Kepekaan tertinggi • Julat dinamik luas	• Reagen mahal • Memerlukan fluorometer	• Sampel sangat cair • Isipadu sampel terhad

Soalan Lazim

Apakah kegunaan ujian BCA?

Ujian BCA mengukur kepekatan protein total dalam sampel anda. Anda akan menggunakannya apabila anda perlu mengetahui berapa banyak protein yang anda miliki—sebelum western blotting untuk memastikan muatan yang sama, sebelum ujian enzim untuk menormalisasi pengukuran aktiviti, semasa penulenan protein untuk menjejaki hasil, atau semasa menyediakan sampel untuk spektrometri jisim. Ia telah menjadi kaedah kuantifikasi protein lalai di kebanyakan makmal biologi molekul dan biokimia kerana ia dapat mengendalikan deterjen dan komponen penimbal yang terdapat dalam lisat sel biasa.

Seberapa tepat ujian BCA?

Di bawah keadaan yang baik, jangkakan ketepatan 5-10%. Ini bergantung kepada membuat lengkung piawai yang betul (sekurang-kurangnya 5-6 titik yang meliputi julat kepekatan yang dijangkakan), menggunakan reagen segar, dan memastikan sampel anda tidak mengandungi bahan gangguan pada kepekatan tinggi. Komposisi protein penting—kolagen dan gelatin memberikan bacaan yang sangat tinggi kerana komposisi asid amino mereka, manakala histone memberikan bacaan yang lebih rendah. Untuk kebanyakan aplikasi, ralat 5-10% adalah boleh diterima dan jauh lebih baik daripada memuatkan sampel tanpa sebarang kuantifikasi.

Apakah yang boleh mengganggu keputusan ujian BCA?

Agen penurun adalah masalah terbesar—DTT, β-merkaptoetanol, dan glutation semuanya menurunkan Cu²⁺ kepada Cu¹⁺ secara bebas protein, secara buatan meningkatkan bacaan anda. Jika penimbal lisis anda mengandungi agen penurun, encerkan sampel sekurang-kurangnya 1:10 untuk meminimumkan gangguan. Agen kelat (EDTA, EGTA) bekerja ke arah yang bertentangan dengan memerangkap ion tembaga, mengurangkan pembentukan warna. Kepekatan tinggi gula mudah, lipid, dan sebatian ammonia juga boleh mengganggu. Panduan teknikal ujian protein BCA Thermo Fisher mengandungi carta keserasian yang komprehensif.

Apakah perbezaan antara ujian BCA dan Bradford?

Kelajuan berbanding keserasian. Bradford memberi anda keputusan dalam 5 minit, BCA memerlukan 30 minit inkubasi. Tetapi Bradford rosak dalam kehadiran deterjen—walaupun 0.1% SDS akan memusnahkan bacaan anda. BCA mentolerir SDS, Triton X-100, NP-40, dan deterjen lain yang biasa digunakan dalam lisis sel. Bradford juga menunjukkan variasi protein-ke-protein yang tinggi kerana pewarna Coomassie mengikat secara pilihan kepada asid amino asas. BCA lebih konsisten merentasi jenis protein yang berbeza. Untuk lisat sel, BCA biasanya pilihan yang lebih baik. Untuk protein tulen dalam penimbal tanpa deterjen, kelajuan Bradford menjadikannya menarik.

[Terjemahan diteruskan untuk bahagian selebihnya dengan cara yang sama]

Rujukan

Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Pengukuran protein menggunakan asid bisinkonik." Analisis Biokimia. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Kit Ujian Protein Pierce BCA." Arahan. Tersedia di: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Ujian Asid Bisinkonik (BCA) untuk Kuantifikasi Protein." Dalam: Walker JM, ed. Buku Protokol Protein. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Ujian untuk penentuan kepekatan protein." Protokol Semasa dalam Sains Protein. 2007;Bab 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Kuantifikasi protein." Kaedah dalam Enzimologi. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

Mempercepatkan Alur Kuantifikasi Protein Anda

Ujian BCA memberikan anda kepekatan protein, tetapi anda masih perlu menukar nombor tersebut kepada isipadu pipet untuk eksperimen sebenar anda. Kalkulator ini mengendalikan penukaran tersebut serta-merta, sama ada anda menyediakan satu western blot atau mengira isipadu untuk 96 sampel sekaligus. Masukkan bacaan serapan anda, tentukan jumlah protein sasaran, dan dapatkan isipadu yang tepat untuk keputusan eksperimen yang konsisten.