DNA Concentratie Calculator | A260 naar ng/μL Converter

DNA-concentratiecalculator

Een DNA-concentratiecalculator zet een UV-absorptiemeting bij 260 nanometer, A260 genoemd, om in een DNA-concentratie in nanogram per microliter (ng/µL). De calculator geeft ook de totale hoeveelheid DNA in een monster weer, in microgram (µg).

Wat is A260-absorptie?

A260 is de hoeveelheid ultraviolet licht die een oplossing absorbeert bij een golflengte van 260 nanometer. DNA absorbeert UV-licht het sterkst rond deze golflengte vanwege de nucleotidebasen. Een spectrofotometer meet A260 na een blanco-meting met dezelfde buffer als het monster, waarmee de achtergrondabsorptie wordt verwijderd. Hoe meer DNA de oplossing bevat, hoe hoger de A260-waarde.

Formule voor de DNA-concentratie

Dubbelstrengs DNA absorbeert UV-licht evenredig aan zijn concentratie, een verband dat bekendstaat als de wet van Beer-Lambert. Bij een standaard lichtpad van 1 centimeter bevat een oplossing met een A260-waarde van 1,0 ongeveer 50 ng/µL dubbelstrengs DNA. Dit getal, de omzettingsfactor, zet elke A260-waarde om in een concentratie:

DNA-concentratie (ng/µL) = A260 × 50 × verdunningsfactor

De verdunningsfactor houdt rekening met elke verdunning die vóór de meting van het monster is uitgevoerd. Voor een onverdund gemeten monster is de verdunningsfactor 1.

Hoe bereken je de totale DNA-opbrengst?

Zodra de concentratie bekend is, kan de totale massa DNA in het monster worden berekend aan de hand van het volume:

Totaal DNA (µg) = concentratie (ng/µL) × volume (µL) ÷ 1000

DNA-concentratie berekenen: stap voor stap

1. Meng het monster grondig vóór de meting. DNA kan aan de wanden van het buisje blijven kleven of ongelijkmatig bezinken.
2. Verdun het monster als het sterk geconcentreerd is, met als doel een A260-waarde tussen 0,1 en 1,0. Buiten dit bereik zijn spectrofotometermetingen het minst betrouwbaar.
3. Stel de spectrofotometer blanco met dezelfde buffer die voor de verdunning is gebruikt en meet het monster vervolgens bij 260 nm.
4. Voer de A260-waarde, het monstervolume en de verdunningsfactor in de calculator in om de concentratie en de totale opbrengst te verkrijgen. Alle drie de velden moeten zijn ingevuld en het volume moet groter zijn dan nul voordat een resultaat verschijnt.

Uitgewerkt voorbeeld

Voorbeeld 1: onverdund monster

Een A260-waarde van 0,5, geen verdunning (verdunningsfactor 1) en een monstervolume van 100 µL.

• Concentratie = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Totaal DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Voorbeeld 2: verdund monster

Een buisje bevat 50 µL gezuiverd DNA. Een kleine hoeveelheid daarvan is 10-voudig verdund en het verdunde deel gaf een A260-waarde van 0,75. De verdunningsfactor zet die waarde terug om naar de concentratie in het oorspronkelijke buisje, en de 50 µL is het volume dat voor de stap van de totale opbrengst wordt ingevoerd.

• Concentratie = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Totaal DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

De verdunningsfactor berekenen

Verdunningsfactor = totaal volume na verdunning ÷ volume van het oorspronkelijke monster.

Door 5 µL DNA-oplossing toe te voegen aan 45 µL buffer ontstaat een totaal volume van 50 µL, dus de verdunningsfactor is 50 ÷ 5 = 10. Voor een niet-verdund monster is de verdunningsfactor 1.

Typische DNA-concentratiebereiken

De concentratie hangt af van het monstertype en de extractiemethode. Genomisch-DNA-extracties vallen doorgaans tussen ongeveer 10 en 100 ng/µL. Plasmide-DNA-preparaten leveren vaak hogere concentraties op, soms enkele honderden ng/µL. Een resultaat dat sterk afwijkt van het verwachte bereik voor een bepaalde methode kan wijzen op een probleem met de extractie of met de meting zelf.

Beperkingen van UV-absorptiemetingen

A260 meten gaat snel, maar het is niet de meest gevoelige of specifieke methode voor DNA. Eiwitten, RNA en sommige buffercomponenten absorberen ook licht rond 260 nm en kunnen de waarde verhogen. Wetenschappers controleren vaak naast de concentratie ook de A260/A280-verhouding om te screenen op eiwitverontreiniging; een verhouding rond 1,8 wijst doorgaans op een zuiver DNA-monster. Methoden op basis van fluorescente kleurstoffen, zoals Qubit-assays, binden alleen aan dubbelstrengs DNA en geven een nauwkeurigere meting voor verdunde of verontreinigde monsters, hoewel daarvoor extra reagentia en een fluorometer nodig zijn.

Veelgestelde vragen

Hoe bereken je de DNA-concentratie uit A260?

Vermenigvuldig de A260-waarde met 50, de standaardomzettingsfactor voor dubbelstrengs DNA, en vermenigvuldig het resultaat vervolgens met de verdunningsfactor. Gebruik voor een niet-verdund monster een verdunningsfactor van 1.

Wat is een goede A260/A280-verhouding?

Een verhouding rond 1,8 wijst doorgaans op een zuiver DNA-monster. Een lagere verhouding wijst op eiwitverontreiniging. Een verhouding boven 2,0 kan wijzen op RNA-verontreiniging.

Kan deze calculator voor RNA worden gebruikt?

Niet rechtstreeks, omdat voor RNA een omzettingsfactor van 40 ng/µL wordt gebruikt in plaats van 50. Om de RNA-concentratie te schatten, vermenigvuldig je het resultaat van de calculator met 0,8 (40 ÷ 50), of gebruik je rechtstreeks A260 × 40 × verdunningsfactor.

Waarom moet de A260-waarde tussen 0,1 en 1,0 liggen?

De absorptie blijft, zoals beschreven door de wet van Beer-Lambert, voornamelijk binnen dit bereik ongeveer evenredig aan de concentratie. Daarbuiten worden metingen minder betrouwbaar; een te geconcentreerd of te verdund monster moet daarom vóór een nieuwe meting worden verdund of geconcentreerd.

Wat is het verschil tussen concentratie en zuiverheid?

De concentratie geeft aan hoeveel DNA aanwezig is, in ng/µL. De zuiverheid geeft aan hoe schoon het monster is en wordt voornamelijk beoordeeld aan de hand van absorptieverhoudingen zoals A260/A280. Een monster kan een hoge concentratie hebben en toch onzuiver zijn, of een lage concentratie en zeer zuiver zijn.

Hoe zet ik ng/µL om naar µg/mL?

De twee eenheden zijn numeriek gelijk. 1 ng/µL is gelijk aan 1 µg/mL, omdat zowel de massa-eenheid als de volume-eenheid met een factor 1000 worden geschaald.

Referenties

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3e ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Kwantificering van DNA en RNA met absorptie- en fluorescentiespectroscopie. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). De waarde van A260/A280-verhoudingen voor het meten van de zuiverheid van nucleïnezuren. BioTechniques, 19(2), 208–210.