DNA Kopiëren Aantal Calculator | Genomische Analyse Tool

DNA-kopienummerteller

Een DNA-kopienummerteller schat hoeveel kopieën van een doelvolgorde in een DNA-monster aanwezig zijn. De berekening gebruikt de concentratie en het volume van het monster en hoe vaak de doelvolgorde in de langere DNA-sequentie voorkomt. Laboratoria voor moleculaire biologie gebruiken deze schatting om experimenten zoals qPCR (kwantitatieve polymerasekettingreactie) te plannen voordat een duurdere, nauwkeurigere analyse wordt uitgevoerd.

Wat het DNA-kopienummer betekent

Het DNA-kopienummer is het aantal keer dat een specifieke sequentie in een genoom of monster voorkomt. Een typisch menselijk gen komt tweemaal voor, eenmaal geërfd van elke ouder. Verschillende factoren kunnen dat aantal veranderen.

• Amplificatie: meer dan twee kopieën. Kankercellen amplificeren vaak genen die de groei stimuleren, zoals HER2 in sommige borsttumoren.
• Deletie: minder dan twee kopieën, soms nul. Deleties kunnen genetische aandoeningen veroorzaken.
• Duplicatie: er verschijnt een extra kopie op een plaats waar er maar één of twee zouden moeten zijn.
• Kopienummervariatie (CNV): een normaal verschil in kopienummer tussen individuen, dat in een aanzienlijk deel van het menselijk genoom voorkomt.

Formule voor het DNA-kopienummer

De teller zet het aantal sequentievoorkomens en de massa van het monster met deze formule om in een kopieaantal:

$\text{Kopienummer} = \frac{\text{Voorkomens} \times \text{Concentratie} \times \text{Volume} \times N_A}{\text{DNA-lengte} \times 660 \times 10^{9}}$

Waarbij:

• Voorkomens — hoe vaak de doelvolgorde in de volledige DNA-sequentie voorkomt; overlappende overeenkomsten worden afzonderlijk geteld.
• Concentratie — DNA-concentratie in nanogram per microliter (ng/μL), doorgaans afgelezen met een spectrofotometer of fluorometer.
• Volume — monstervolume in microliter (μL).
• $N_A$ — het getal van Avogadro, 6,022 × 10²³ moleculen per mol. Hiermee worden mol DNA omgerekend naar een aantal moleculen.
• DNA-lengte — de lengte van de volledige DNA-sequentie, in baseparen.
• 660 — de gemiddelde molecuulmassa van één DNA-basepaar, in gram per mol (g/mol). Een basepaar bestaat uit twee gepaarde nucleotiden, één van elke DNA-streng.
• 10⁹ — hiermee worden nanogrammen omgerekend naar gram.

De formule zet eerst de massa van het monster om in mol DNA-moleculen, vermenigvuldigt die met het getal van Avogadro om het totale aantal DNA-moleculen in het monster te verkrijgen, en vermenigvuldigt dat vervolgens met het aantal keer dat de doelvolgorde in elk molecuul voorkomt.

De tool accepteert alleen de letters A, T, C en G. Spaties en regeleinden worden genegeerd, en kleine letters tellen hetzelfde als hoofdletters.

Zo berekent u het DNA-kopienummer: uitgewerkt voorbeeld

Neem een DNA-sequentie van 12 baseparen, ATCGATCGATCG, met een doelvolgorde van ATCG, een concentratie van 10 ng/μL en een volume van 20 μL.

Stap 1: tel de voorkomens. ATCG komt 3 keer voor in ATCGATCGATCG (op posities 1, 5 en 9).

Stap 2: bepaal de totale DNA-massa. Concentratie × volume = 10 × 20 = 200 ng.

Stap 3: reken om naar mol. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Deel dit door (12 baseparen × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Dat geeft 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Stap 4: reken om naar het aantal moleculen. Vermenigvuldig met het getal van Avogadro: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ moleculen/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-moleculen.

Stap 5: vermenigvuldig met het aantal voorkomens. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, oftewel ongeveer 45.621.212.121.212 kopieën.

Dit getal lijkt enorm, omdat een monster van 20 μL met 10 ng/μL nog steeds biljoenen korte DNA-moleculen bevat. In echte monsters worden doorgaans veel langere sequenties gebruikt, waardoor het aantal moleculen bij dezelfde massa lager uitvalt.

Waar DNA-kopienummeranalyse wordt gebruikt

Kankerdiagnostiek. Pathologielaboratoria controleren het kopienummer van HER2 in borsttumorweefsel. Een normale cel bevat twee kopieën. Een geamplificeerde tumor kan er zes of meer bevatten, wat van invloed is op de geschiktheid voor doelgerichte geneesmiddelen zoals trastuzumab.

Onderzoek naar genetische aandoeningen. Bij aandoeningen zoals het DiGeorge-syndroom ontbreekt een segment van een chromosoom. Het syndroom van Down houdt verband met een extra kopie van chromosoom 21 (trisomie 21). Het tellen van kopieën helpt deze diagnoses te bevestigen.

Kwantificering van transgenen en plasmiden. Onderzoekers controleren hoeveel kopieën van een ingevoegd gen in een plant, dier of bacteriecel terecht zijn gekomen. Eén kopie heeft doorgaans de voorkeur, omdat meerdere kopieën de cel ertoe kunnen aanzetten het gen het zwijgen op te leggen.

Monitoring van ziekteverwekkers en virale belasting. Schattingen van het kopienummer brengen in kaart hoeveel viraal of bacterieel DNA in een monster aanwezig is. Dit wordt gebruikt bij infectiemonitoring en milieutests.

Andere methoden om het kopienummer te meten

Deze teller geeft een snelle schatting op basis van sequentie- en concentratiegegevens. Laboratoria die meer nauwkeurigheid nodig hebben, gebruiken doorgaans een van de volgende methoden:

• Kwantitatieve PCR (qPCR): amplificeert en meet DNA in realtime; met een goede standaardcurve is de nauwkeurigheid ongeveer 15–20%.
• Digitale PCR (dPCR): verdeelt een monster over duizenden kleine reacties om rechtstreeks te tellen, zonder dat een standaardcurve nodig is.
• Fluorescentie-in-situhybridisatie (FISH): telt sequenties rechtstreeks onder een microscoop in cellen of chromosomen; dit is de standaardmethode in veel laboratoria voor kankerdiagnostiek.
• Sequencing van de volgende generatie (NGS): sequentieert het volledige monster en brengt het kopienummer in het hele genoom tegelijk in kaart.

Veelgestelde vragen

Wat is het DNA-kopienummer? Het is het aantal keer dat een bepaalde DNA-sequentie in een genoom of monster voorkomt. De meeste menselijke genen komen tweemaal voor, eenmaal van elke ouder. Extra of ontbrekende kopieën kunnen de gezondheid en het risico op ziekten beïnvloeden.

Hoe nauwkeurig is deze teller? De teller geeft een theoretische schatting op basis van de ingevoerde gegevens, geen laboratoriummeting. De nauwkeurigheid hangt af van hoe precies de concentratie is gemeten en hoe specifiek de doelvolgorde is. Methoden zoals digitale PCR zijn nauwkeuriger voor gepubliceerde resultaten.

Kan deze teller voor RNA worden gebruikt? Nee. RNA gebruikt uracil in plaats van thymine en een andere suiker, waardoor de molecuulmassa verschilt van die van DNA. RNA heeft een gemiddelde molecuulmassa van ongeveer 330 g/mol per nucleotide, tegenover ongeveer 660 g/mol per DNA-basepaar. Als de DNA-formule op RNA-gegevens wordt toegepast, levert dat een onjuist antwoord op.

Waarom wordt een overlappende sequentie meer dan eenmaal geteld? De teller telt elke positie waarop de doelvolgorde overeenkomt, ook als overeenkomsten letters delen. In ATATAT komt de sequentie ATA tweemaal overeen, op positie 1 en positie 3, omdat elke startpositie afzonderlijk wordt gecontroleerd.

Welk bereik van DNA-concentraties werkt het best? Concentraties van 10–100 ng/μL geven de betrouwbaarste metingen op standaardlaboratoriuminstrumenten. Onder 10 ng/μL neemt de meetfout toe en wordt een gevoeligere methode, zoals een fluorometer, aanbevolen boven een standaard spectrofotometer.

Kan deze teller het plasmidekopienummer schatten? Ja. Voer de volledige plasmidesequentie in als DNA-sequentie en een uniek gebied van het insert als doelvolgorde, samen met de gemeten plasmideconcentratie en het monstervolume.