DNA Hybridisatietemperatuur Calculator | Gratis PCR Tm Gereedschap

Wat is een calculator voor de annealingtemperatuur van DNA?

Een calculator voor de annealingtemperatuur van DNA schat de smelttemperatuur (Tm) van een DNA-primer op basis van diens sequentie. Tm is de temperatuur waarbij de helft van de primermoleculen aan hun doelstreng gebonden is en de andere helft niet. Bij een polymerasekettingreactie (PCR) bepaalt deze waarde de temperatuur waarbij primers zich aan het DNA-matrijs binden.

Waarom de annealingtemperatuur belangrijk is bij PCR

Met PCR wordt een doelgebied van DNA gekopieerd via herhaalde verwarmings- en afkoelingscycli. Elke cyclus bestaat uit drie stappen. Eerst worden de twee strengen van het dubbelstrengs matrijs-DNA bij ongeveer 95 °C van elkaar gescheiden. Deze stap heet denaturatie. Vervolgens koelt de reactie af tot de annealingtemperatuur, meestal tussen 50 °C en 65 °C, zodat korte primers zich kunnen binden aan overeenkomstige sequenties op de enkelstrengen. Ten slotte stijgt de temperatuur tot ongeveer 72 °C en verlengt een enzym met de naam DNA-polymerase de primers om nieuwe DNA-strengen op te bouwen.

Als de annealingtemperatuur te laag is, binden primers aan sequenties die slechts gedeeltelijk overeenkomen, waardoor extra ongewenste DNA-fragmenten ontstaan. Als de temperatuur te hoog is, kunnen primers geen stabiele binding met het matrijs-DNA vormen en wordt weinig of geen DNA gekopieerd. De annealingtemperatuur is een van de eerste instellingen die onderzoekers aanpassen wanneer een PCR-reactie mislukt.

Hoe het GC-gehalte Tm beïnvloedt

Een primer paart met zijn doelstreng via waterstofbruggen. Een guanine-cytosinepaar (G-C) vormt drie waterstofbruggen. Een adenine-thyminepaar (A-T) vormt er twee. Voor het losmaken van een primer met meer G- en C-basen is meer warmte nodig, waardoor deze een hogere Tm heeft dan een primer van dezelfde lengte met meer A- en T-basen. Het GC-gehalte wordt meestal als percentage weergegeven: het aantal G- en C-basen gedeeld door de totale sequentielengte, vermenigvuldigd met 100.

Formule voor de annealingtemperatuur van DNA

Deze calculator past een van twee formules toe, afhankelijk van de primerlengte.

Voor primers van 14 nucleotiden of langer gebruikt de calculator de formule voor het GC-gehalte van Marmur-Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Hierbij is N_GC het aantal G- en C-basen in de primer, rechtstreeks geteld en niet als percentage. N is het totale aantal basen.

Voor primers korter dan 14 nucleotiden gebruikt de calculator de regel van Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G en C staan elk voor het aantal keer dat de betreffende base in de primer voorkomt.

Beide formules gaan uit van gebruikelijke PCR-omstandigheden: ongeveer 50 nanomolair primer en 50 millimolair Na+.

Uitgewerkt voorbeeld

Neem de primer van 19 basen ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. De lengte is 19, wat 14 of meer is, dus gebruikt de calculator de formule van Marmur-Doty.

• Lengte (N) = 19
• aantal G = 5, aantal C = 5, dus N_GC = 10, en het GC-gehalte is 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

De formule gebruikt het GC-aantal, 10, niet het GC-percentage, 52,6. Als het percentage per vergissing wordt gebruikt, komt de Tm uit op ongeveer 143 °C, wat geen realistische waarde is voor een PCR-reactie die wordt uitgevoerd tussen 50 °C en 95 °C.

Deze calculator gebruiken

Typ of plak een primersequentie die alleen de letters A, T, G en C bevat. De calculator toont de sequentielengte in nucleotiden (nt), het GC-gehalte als percentage en de berekende annealingtemperatuur in graden Celsius. Het resultaat kan worden gekopieerd naar labnotities of een protocol.

Een annealingtemperatuur voor PCR kiezen

Tm is een berekende schatting en geen gegarandeerde werktemperatuur. Veel PCR-protocollen beginnen de eigenlijke annealingstap enkele graden onder de berekende Tm en passen de temperatuur vervolgens aan op basis van het resultaat op een gel. Voor een primerpaar wordt normaal gesproken de laagste van de twee Tm-waarden als uitgangspunt gebruikt. Een gradiënt-PCR, waarbij meerdere reacties tegelijk bij verschillende temperaturen worden uitgevoerd, is een gebruikelijke manier om door testen de beste temperatuur te vinden.

Andere manieren om Tm te schatten

De formules van Marmur-Doty en Wallace die hier worden gebruikt, zijn snelle benaderingen die alleen op de basissamenstelling zijn gebaseerd. Er bestaan ook andere methoden:

• De thermodynamica van naaste buren houdt rekening met de invloed van elk aangrenzend basenpaar op de stabiliteit en geldt als de nauwkeurigere methode voor standaardprimers.
• Formules met zoutcorrectie voegen een correctie toe voor de concentratie Na+- of K+-ionen in de reactiebuffer, omdat een hogere zoutconcentratie het DNA-duplex stabiliseert en de Tm verhoogt.

Verschillende calculators kunnen voor dezelfde primer verschillende Tm-waarden rapporteren omdat ze verschillende formules gebruiken. De PCR uitvoeren en het resultaat controleren blijft de uiteindelijke test.

Veelgestelde vragen

Wat is de annealingtemperatuur van DNA?

Dit is de temperatuur waarbij DNA-primers zich tijdens PCR binden aan hun overeenkomstige sequentie op een matrijsstreng. In laboratoria wordt deze temperatuur meestal enkele graden onder de berekende smelttemperatuur (Tm) van de primer ingesteld.

Hoe wordt de Tm van een primer berekend?

Voor primers van 14 basen of langer geldt: Tm = 64,9 + 41 × (GC-aantal − 16,4) / lengte. Voor primers korter dan 14 basen geldt: Tm = 2 × (aantal A+T) + 4 × (aantal G+C).

Waarom verhoogt het GC-gehalte de Tm?

G-C-basparen vormen drie waterstofbruggen, tegenover twee bij A-T-paren. Een primer met een hoger gehalte aan G- en C-basen heeft meer energie en dus een hogere temperatuur nodig om van de doelstreng los te komen.

Moet de annealingtemperatuur van de PCR gelijk zijn aan de berekende Tm?

Nee. De meeste protocollen beginnen enkele graden onder de berekende Tm en passen de temperatuur van daaruit aan, omdat Tm het punt aangeeft waarop slechts de helft van de primer gebonden is.

Verandert de primerlengte de Tm?

Ja, hoewel niet op een eenvoudige manier. De lengte staat in de noemer van de formule van Marmur-Doty. Daarom heeft een langere primer met een gemiddeld GC-gehalte niet automatisch een hogere Tm dan een kortere primer die rijk is aan GC.

Waarom geven verschillende Tm-calculators verschillende resultaten?

Ze gebruiken verschillende formules. De regel van Wallace, de GC-gehalteformule van Marmur-Doty, thermodynamica volgens het nearest-neighbor-model en formules met zoutcorrectie kunnen elk een andere Tm voor dezelfde primer opleveren, soms met verschillen van meerdere graden.

Referenties

1. Marmur J, Doty P. Bepaling van de basissamenstelling van desoxyribonucleïnezuur aan de hand van de thermische denaturatietemperatuur. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridisatie van synthetische oligodeoxyribonucleotiden met phi chi 174-DNA. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Een geïntegreerde visie op de thermodynamica van polymeer-, dumbbell- en oligonucleotide-DNA volgens het nearest-neighbor-model. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.