DNA Ligation Calculator

Inleiding

DNA-ligatie is een cruciale techniek in de moleculaire biologie die wordt gebruikt om DNA-fragmenten samen te voegen met covalente bindingen. De DNA Ligation Calculator is een essentieel hulpmiddel voor onderzoekers, dat helpt bij het bepalen van de optimale hoeveelheden vector- en insert-DNA die nodig zijn voor succesvolle ligatiereacties. Door de juiste molaire verhoudingen tussen vector (plasmide) en insert-DNA-fragmenten te berekenen, zorgt deze calculator voor efficiënte moleculaire kloonexperimenten en minimaliseert het verspilling van reagentia en mislukte reacties.

Ligatiereacties zijn fundamenteel voor genetische engineering, synthetische biologie en procedures voor moleculaire kloonvorming. Ze stellen wetenschappers in staat om recombinant DNA-moleculen te creëren door genen van belang in plasmidevectoren in te voegen voor daaropvolgende transformatie in gastorganismen. Het succes van deze reacties hangt sterk af van het gebruik van de juiste hoeveelheden DNA-componenten, wat precies is wat deze calculator helpt te bepalen.

Of je nu expressievectoren construeert, genbibliotheken creëert of routinematig subclonings uitvoert, deze DNA-ligatiecalculator helpt je om je experimentele omstandigheden te optimaliseren en je slagingspercentage te verhogen. Door een paar belangrijke parameters over je DNA-monsters in te voeren, kun je snel de exacte volumes verkrijgen die nodig zijn voor je specifieke ligatiereactie.

Formule/Berekening

De DNA-ligatiecalculator gebruikt een fundamentele formule uit de moleculaire biologie die rekening houdt met de verschillende maten en concentraties van de te verbinden DNA-fragmenten. De primaire berekening bepaalt hoeveel insert-DNA nodig is ten opzichte van het vector-DNA op basis van hun respectieve lengtes en de gewenste molaire verhouding.

Berekening van de Insert Hoeveelheid

De hoeveelheid insert-DNA die nodig is (in nanogram) wordt berekend met de volgende formule:

$\text{ng van insert} = \text{ng van vector} \times \frac{\text{kb-grootte van insert}}{\text{kb-grootte van vector}} \times \text{molaire verhouding}$

Waarbij:

• ng van vector = hoeveelheid vector-DNA die in de reactie wordt gebruikt (typisch 50-100 ng)
• kb-grootte van insert = lengte van het insert-DNA-fragment in kilobasen (kb)
• kb-grootte van vector = lengte van het vector-DNA in kilobasen (kb)
• molaire verhouding = gewenste verhouding van insert-moleculen tot vector-moleculen (typisch 3:1 tot 5:1)

Volume Berekeningen

Zodra de vereiste hoeveelheid insert-DNA is bepaald, worden de benodigde volumes voor de reactie berekend:

$\text{Vectorvolume (μL)} = \frac{\text{ng van vector}}{\text{vectorconcentratie (ng/μL)}}$

$\text{Insertvolume (μL)} = \frac{\text{ng van insert}}{\text{insertconcentratie (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/watervolume (μL)} = \text{Totaal reactvolume (μL)} - \text{Vectorvolume (μL)} - \text{Insertvolume (μL)}$

Voorbeeldberekening

Laten we een praktisch voorbeeld doorlopen:

• Vectorconcentratie: 50 ng/μL
• Vectorgrootte: 3000 bp (3 kb)
• Insertconcentratie: 25 ng/μL
• Insertgrootte: 1000 bp (1 kb)
• Gewenste molaire verhouding (insert:vector): 3:1
• Totaal reactvolume: 20 μL
• Hoeveelheid vector om te gebruiken: 50 ng

Stap 1: Bereken de vereiste insert hoeveelheid $\text{ng van insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Stap 2: Bereken de volumes $\text{Vectorvolume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insertvolume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/watervolume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Deze berekening zorgt ervoor dat er drie insert-moleculen zijn voor elke vector-molecuul in de reactie, wat de kans op succesvolle ligatie optimaliseert.

Stapsgewijze gids voor het gebruik van de calculator

Onze DNA Ligation Calculator is ontworpen om intuïtief en eenvoudig te zijn. Volg deze stappen om de optimale volumes voor je ligatiereactie te berekenen:

1. Voer Vectorinformatie in:

   • Voer je vectorconcentratie in ng/μL in
   • Voer de vectorgrootte in in baseparen (bp)
   • Geef de hoeveelheid vector-DNA op die je wilt gebruiken in de reactie (ng)

2. Voer Insertinformatie in:

   • Voer je insertconcentratie in ng/μL in
   • Voer de insertgrootte in in baseparen (bp)

3. Stel Reactieparameters in:

   • Geef de gewenste molaire verhouding (insert:vector) op - typisch tussen 3:1 en 5:1
   • Voer het totale reactvolume in μL in (meestal 10-20 μL)

4. Bekijk Resultaten:

   • De calculator toont automatisch:
     • Vereist vectorvolume (μL)
     • Vereist insertvolume (μL)
     • Toe te voegen buffer/watervolume (μL)
     • Totaal reactvolume (μL)
     • Hoeveelheid vector en insert-DNA in de reactie (ng)

5. Kopieer Resultaten (optioneel):

   • Gebruik de knop "Kopieer Resultaten" om alle berekeningen naar je klembord te kopiëren voor je labnotities of protocollen

De calculator voert validatiecontroles uit om ervoor te zorgen dat alle invoerwaarden positieve getallen zijn en dat het totale volume voldoende is voor de vereiste DNA-volumes. Als er fouten worden gedetecteerd, zullen nuttige foutmeldingen je begeleiden om de invoer te corrigeren.

Toepassingen

De DNA Ligation Calculator is waardevol in tal van toepassingen in de moleculaire biologie:

Moleculaire Kloonvorming

De meest voorkomende toepassing is standaard moleculaire kloonvorming, waarbij onderzoekers genen of DNA-fragmenten in plasmidevectoren invoegen. De calculator zorgt voor optimale omstandigheden voor:

• Subcloning van genen tussen verschillende expressievectoren
• Creëren van fusie-eiwitten door meerdere genfragmenten samen te voegen
• Constructie van reporter-genassays
• Bouwen van plasmidebibliotheken

Synthetische Biologie

In de synthetische biologie, waar vaak meerdere DNA-fragmenten worden samengevoegd:

• Gibson Assembly-reacties profiteren van nauwkeurige insert:vector-verhoudingen
• Golden Gate-assemblagesystemen vereisen specifieke DNA-concentraties
• BioBrick-assemblage van gestandaardiseerde genetische onderdelen
• Constructie van synthetische genetische circuits

Ontwikkeling van Diagnostische Kits

Bij het ontwikkelen van moleculaire diagnostische hulpmiddelen:

• Kloon van ziekte-specifieke genetische merkers
• Constructie van positieve controle-plasmiden
• Ontwikkeling van calibratiestandaarden voor qPCR

Eiwitexpressiesystemen

Voor onderzoekers die zich bezighouden met eiwitproductie:

• Optimaliseren van insert:vector-verhoudingen voor high-copy-expressievectoren
• Constructie van induceerbare expressiesystemen
• Creëren van secretievectoren voor eiwitzuivering

CRISPR-Cas9 Toepassingen

In toepassingen voor genoombewerking:

• Kloon van gids-RNA's in CRISPR-vectoren
• Creëren van donor-sjablonen voor homologie-gestuurde reparatie
• Bouwen van bibliotheken van gids-RNA's voor screening

Uitdagende Ligaties

De calculator is bijzonder waardevol voor uitdagende ligatiescenario's:

• Kloon van grote inserts (>5 kb)
• Zeer kleine fragmentinvoegingen (<100 bp)
• Blunt-end ligaties die een lagere efficiëntie hebben
• Multi-fragment assemblage-reacties

Alternatieven

Hoewel onze DNA Ligation Calculator nauwkeurige berekeningen biedt voor traditionele ligatiereacties, bestaan er verschillende alternatieve benaderingen voor het samenvoegen van DNA-fragmenten:

1. Gibson Assembly: Gebruikt exonuclease, polymerase en ligase in een enkele buisreactie om overlappende DNA-fragmenten samen te voegen. Geen traditionele ligatieberekening is nodig, maar concentratieverhoudingen zijn nog steeds belangrijk.

2. Golden Gate Assembly: Gebruikt Type IIS-restrictie-enzymen voor directionele, scarless assemblage van meerdere fragmenten. Vereist equimolaire hoeveelheden van alle fragmenten.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Gebruikt exonuclease om enkelstrengige overhangen te creëren die aan elkaar annealen. Typisch gebruik van equimolaire verhoudingen van fragmenten.

4. In-Fusion Cloning: Commercieel systeem dat het samenvoegen van fragmenten met 15 bp-overlappingen mogelijk maakt. Gebruikt een specifieke verhouding op basis van fragmentgroottes.

5. Gateway Cloning: Gebruikt sitespecifieke recombinatie in plaats van ligatie. Vereist specifieke invoer- en bestemmingsvectoren.

6. Empirisch Testen: Sommige laboratoria geven de voorkeur aan het opzetten van meerdere ligatiereacties met verschillende insert:vector-verhoudingen (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) en bepalen welke het beste werkt voor hun specifieke constructen.

7. Softwarecalculators: Commerciële softwarepakketten zoals Vector NTI en SnapGene bevatten ligatiecalculators met extra functies zoals restrictieplaatsanalyse.

Geschiedenis

De ontwikkeling van DNA-ligatieberekeningen loopt parallel aan de evolutie van moleculaire kloontechnieken, die de moleculaire biologie en biotechnologie hebben revolutionair gemaakt.

Vroege Ontwikkelingen (1970s)

Het concept van DNA-ligatie voor moleculaire kloonvorming kwam op in de vroege jaren 1970 met het pionierswerk van Paul Berg, Herbert Boyer en Stanley Cohen, die de eerste recombinant DNA-moleculen ontwikkelden. Gedurende deze periode waren ligatiereacties grotendeels empirisch, waarbij onderzoekers trial-and-error gebruikten om optimale omstandigheden te bepalen.

De ontdekking van restrictie-enzymen en DNA-ligase bood de essentiële hulpmiddelen voor het knippen en opnieuw samenvoegen van DNA-moleculen. T4 DNA-ligase, geïsoleerd uit T4-bacteriofaag-geïnfecteerde E. coli, werd de standaardenzym voor het samenvoegen van DNA-fragmenten vanwege zijn vermogen om zowel blunt- als cohesieve uiteinden te ligeren.

Verfijningsperiode (1980s-1990s)

Naarmate moleculaire kloonvorming gebruikelijker werd, begonnen onderzoekers meer systematische benaderingen voor ligatiereacties te ontwikkelen. Het belang van molaire verhoudingen tussen vector- en insert-DNA werd duidelijk, wat leidde tot de ontwikkeling van de basisformule die nog steeds wordt gebruikt.

Gedurende deze periode vestigden onderzoekers dat een overmaat aan insert-DNA (typisch 3:1 tot 5:1 molaire verhouding van insert tot vector) over het algemeen de ligatie-efficiëntie verbeterde voor standaard kloonapplicaties. Deze kennis werd aanvankelijk gedeeld via laboratoriumprotocollen en vond geleidelijk zijn weg naar handboeken en tekstboeken in de moleculaire biologie.

Moderne Tijd (2000s-Heden)

De opkomst van computationele hulpmiddelen en online calculators in de jaren 2000 maakte nauwkeurige ligatieberekeningen toegankelijker voor onderzoekers. Naarmate moleculaire biologie technieken complexer werden, werd de behoefte aan nauwkeurige berekeningen kritischer, vooral voor uitdagende kloonprojecten die meerdere fragmenten of grote inserts omvatten.

Tegenwoordig zijn DNA-ligatieberekeningen een integraal onderdeel van moleculaire kloonwerkstromen, met speciale calculators zoals deze die onderzoekers helpen hun experimenten te optimaliseren. De basisformule is grotendeels ongewijzigd gebleven, hoewel ons begrip van de factoren die de ligatie-efficiëntie beïnvloeden is verbeterd.

De opkomst van alternatieve kloonmethoden zoals Gibson Assembly en Golden Gate kloonvorming heeft nieuwe berekeningsbehoeften geïntroduceerd, maar het fundamentele concept van molaire verhoudingen tussen DNA-fragmenten blijft belangrijk in al deze technieken.

Code Voorbeelden

Hier zijn implementaties van de DNA-ligatiecalculator in verschillende programmeertalen:

1' Excel VBA Functie voor DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Bereken vereiste insert hoeveelheid in ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Bereken vectorvolume in μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Bereken insertvolume in μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Bereken buffer/watervolume in μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Voorbeeldgebruik in een cel:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Bereken volumes voor een DNA-ligatiereactie.
5    
6    Parameters:
7    vector_concentratie (float): Concentratie van vector-DNA in ng/μL
8    vector_length (float): Lengte van vector-DNA in baseparen
9    insert_concentratie (float): Concentratie van insert-DNA in ng/μL
10    insert_length (float): Lengte van insert-DNA in baseparen
11    molar_ratio (float): Gewenste molaire verhouding van insert:vector
12    totaal_volume (float): Totaal reactvolume in μL
13    vector_amount (float): Hoeveelheid vector-DNA om te gebruiken in ng (standaard: 50)
14    
15    Returns:
16    dict: Woordenboek met berekende volumes en hoeveelheden
17    """
18    # Bereken vectorvolume
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Bereken vereiste insert hoeveelheid
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Bereken insertvolume
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Bereken buffer/watervolume
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Voorbeeldgebruik
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Totaal: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Converteer lengtes naar kb voor berekening
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Bereken vereiste insert hoeveelheid
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Bereken volumes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Voorbeeldgebruik
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Totaal: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Converteer lengtes naar kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Bereken vereiste insert hoeveelheid
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Bereken volumes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Afronden op 2 decimalen
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Totaal: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Converteer lengtes naar kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Bereken vereiste insert hoeveelheid
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Bereken volumes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Afronden op 2 decimalen
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Totaal: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Veelgestelde Vragen (FAQ)

Wat is de optimale molaire verhouding voor DNA-ligatie?

De optimale molaire verhouding van insert tot vector ligt doorgaans tussen 3:1 en 5:1 voor standaard ligatiereacties. Dit kan echter variëren afhankelijk van het specifieke ligatiescenario:

• Voor blunt-end ligaties: 3:1 tot 5:1
• Voor sticky-end ligaties: 1:1 tot 3:1
• Voor grote inserts (>10 kb): 1:1 tot 2:1
• Voor kleine inserts (<500 bp): 5:1 tot 10:1
• Voor multi-fragment assemblage: 3:1 voor elke insert tot vector

Waarom mislukt mijn ligatiereactie ondanks het gebruik van de berekende volumes?

Verschillende factoren kunnen de ligatie-efficiëntie beïnvloeden, naast de molaire verhouding:

1. DNA-kwaliteit: Zorg ervoor dat zowel vector als insert schone uiteinden hebben zonder schade
2. Dephosphorylatie: Controleer of je vector is gedephosphoryleerd, wat zelfligatie voorkomt
3. Enzymactiviteit: Controleer of je ligase actief is en op de juiste temperatuur wordt gebruikt
4. Incubatietijd: Sommige ligaties profiteren van een langere incubatie (overnacht bij 16°C)
5. Bufferomstandigheden: Zorg ervoor dat de juiste buffer met ATP wordt gebruikt
6. Verontreinigingen: Zuiver DNA om remmers zoals EDTA of hoge zoutconcentraties te verwijderen

Hoeveel vector-DNA moet ik gebruiken in een ligatiereactie?

Typisch wordt 50-100 ng vector-DNA aanbevolen voor standaard ligatiereacties. Te veel vector kan leiden tot een hogere achtergrond van ongesneden of zelf-geligaeerde vector, terwijl te weinig de transformatie-efficiëntie kan verminderen. Voor uitdagende ligaties moet je deze hoeveelheid mogelijk optimaliseren.

Moet ik berekeningen aanpassen voor blunt-end versus sticky-end ligaties?

Ja. Blunt-end ligaties zijn over het algemeen minder efficiënt dan sticky-end (cohesieve einde) ligaties. Voor blunt-end ligaties gebruik:

• Hogere molaire verhoudingen (3:1 tot 5:1 of zelfs hoger)
• Meer T4 DNA-ligase (typisch 2-3 keer meer)
• Langere incubatietijden
• Overweeg het toevoegen van PEG om de ligatie-efficiëntie te verbeteren

Hoe bereken ik ligatie voor meerdere inserts?

Voor assemblage van meerdere fragmenten:

1. Bereken elke insert hoeveelheid afzonderlijk met dezelfde formule
2. Houd dezelfde totale molaire verhouding aan (bijv. voor twee inserts, gebruik 1.5:1.5:1 insert1:insert2:vector)
3. Pas het totale reactvolume aan om alle DNA-fragmenten te kunnen bevatten
4. Overweeg sequentiële ligatie of het gebruik van assemblagemethoden zoals Gibson Assembly voor meerdere fragmenten

Kan ik deze calculator gebruiken voor Gibson Assembly of Golden Gate Assembly?

Deze calculator is specifiek ontworpen voor traditionele restrictie-enzym- en ligase-gebaseerde kloonvorming. Voor Gibson Assembly worden doorgaans equimolaire hoeveelheden van alle fragmenten aanbevolen (1:1 verhouding), hoewel de basisberekening van DNA-hoeveelheid op basis van lengte vergelijkbaar is. Voor Golden Gate Assembly worden ook doorgaans equimolaire verhoudingen van alle componenten gebruikt.

Hoe houd ik rekening met de dephosphorylatie van de vector in mijn berekeningen?

De dephosphorylatie van de vector (verwijderen van 5' fosfaatgroepen) voorkomt zelfligatie, maar verandert de hoeveelheid berekeningen niet. Voor gedephosphoryleerde vectoren:

1. Gebruik verse insert-DNA met intacte 5' fosfaten
2. Overweeg het gebruik van iets hogere insert:vector verhoudingen (4:1 tot 6:1)
3. Zorg voor langere ligatietijden (minimaal 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 16°C)

Wat is het minimale totale reactvolume dat ik moet gebruiken?

Het minimale praktische reactvolume is doorgaans 10 μL, wat zorgt voor voldoende menging en verdampingsproblemen voorkomt. Als je berekende DNA-volumes het gewenste reactvolume overschrijden, heb je verschillende opties:

1. Gebruik meer geconcentreerde DNA-monsters
2. Verlaag de hoeveelheid vector die wordt gebruikt (bijv. 25 ng in plaats van 50 ng)
3. Verhoog het totale reactvolume
4. Overweeg het concentreren van je DNA-monsters

Hoe lang moet ik mijn ligatiereactie incuberen?

Optimale incubatietijden variëren afhankelijk van het type ligatie:

• Sticky-end ligaties: 1 uur bij kamertemperatuur (22-25°C) of 4-16 uur bij 16°C
• Blunt-end ligaties: 2-4 uur bij kamertemperatuur of 's nachts (12-16 uur) bij 16°C
• Snelle ligaties (met hoogconcentratie ligase): 5-15 minuten bij kamertemperatuur

Kan ik de overgebleven ligatiereactie hergebruiken voor transformatie?

Ja, ligatiemengsels kunnen doorgaans worden opgeslagen bij -20°C en opnieuw worden gebruikt voor transformatie. Elke vries-dooi-cyclus kan echter de efficiëntie verminderen. Voor de beste resultaten:

1. Aliquote het ligatiemengsel voordat je het invriest
2. Verhit inactiveren van de ligase (65°C gedurende 10 minuten) voordat je het opslaat
3. Gebruik binnen 1-2 maanden voor optimale resultaten

Referenties

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3e ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4e ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/