DNA Ligatie Calculator - Bereken Insert:Vector Verhoudingen voor Moleculaire Klonering

DNA-ligatie is de stap bij moleculair kloneren waarbij een insertfragment door het enzym T4-DNA-ligase aan een plasmidevector wordt gekoppeld. Een DNA-ligatiecalculator berekent hoeveel microliter insert-DNA en vector-DNA moet worden gemengd om de reactie een gekozen molaire verhouding van insert tot vector te geven.

Wat de calculator doet

De calculator gebruikt zes invoerwaarden: de vectorconcentratie, de vectorlengte, de insertconcentratie, de insertlengte, de gewenste molaire verhouding van insert tot vector en het totale reactievolume. Ook kan de gebruiker instellen hoeveel vector-DNA wordt gebruikt; dit staat standaard op 50 nanogram (ng). Met deze waarden berekent de calculator het te pipetteren volume vector, het te pipetteren volume insert en de hoeveelheid buffer of water die moet worden toegevoegd om het totale reactievolume te bereiken.

De concentratie wordt gemeten in nanogram per microliter (ng/μL), meestal afgelezen met een Nanodrop- of Qubit-instrument. De lengte wordt gemeten in baseparen (bp). Eén kilobase (kb) is gelijk aan 1000 baseparen. De molaire verhouding geeft aan hoeveel insertmoleculen er per vectormolecuul aanwezig moeten zijn. Het is geen massaverhouding.

Waarom een molaire verhouding en geen massa wordt gebruikt

Gelijke massa's DNA bevatten niet evenveel moleculen. Een kort insert weegt minder dan een lange vector bij hetzelfde aantal moleculen. Als gelijke hoeveelheden in nanogram van een kort insert en een lange vector worden gemengd, zouden er veel te weinig insertmoleculen zijn in verhouding tot het aantal vectormoleculen. De calculator schaalt de massa van het insert op basis van de verhouding tussen de fragmentlengtes, zodat het uiteindelijke mengsel het bedoelde aantal insertmoleculen per vectormolecuul bevat.

Formule voor DNA-ligatie

De benodigde hoeveelheid insert-DNA, in nanogram, is:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

waarbij $m_i$ de hoeveelheid insert in nanogram is, $m_v$ de hoeveelheid vector in nanogram, $k_i$ de lengte van het insert in kilobasen, $k_v$ de lengte van de vector in kilobasen, en R de beoogde molaire verhouding van insert tot vector.

Zodra deze hoeveelheid bekend is, zet de calculator elke hoeveelheid om in een te pipetteren volume:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

waarbij $V_v$ en $V_i$ de volumes van de vector en het insert in microliter zijn, $c_v$ en $c_i$ de concentraties van de vector en het insert in nanogram per microliter zijn, $V_b$ het buffervolume is en $V_t$ het totale reactievolume.

Als de vector- en insertvolumes samen groter zijn dan het totale reactievolume, blijft er geen ruimte over voor buffer, ligase of water. In dat geval meldt de calculator dat het totale volume te klein is, in plaats van een negatief buffervolume te tonen.

Uitgewerkt voorbeeld

Een onderzoeker kloneert een genfragment van 1 kb in een plasmidevector van 3 kb. Het plan is om 50 ng vector-DNA te gebruiken bij een molaire insert:vector-verhouding van 3:1, in een reactie van 20 μL.

Invoer:

• Vectorconcentratie: 50 ng/μL
• Vectorlengte: 3000 bp (3 kb)
• Insertconcentratie: 25 ng/μL
• Insertlengte: 1000 bp (1 kb)
• Molaire verhouding: 3
• Totaal volume: 20 μL
• Hoeveelheid vector: 50 ng

Stap 1: hoeveelheid insert

ng insert = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Stap 2: volumes

Vectorvolume = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Insertvolume = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Buffervolume = 20 − 1 − 2 = 17 μL

De reactie bestaat uit 1 μL vector, 2 μL insert en 17 μL buffer of water; hieraan worden ook het ligase en de reactiebuffer daarvan toegevoegd. Dit mengsel geeft drie insertmoleculen per vectormolecuul.

Gebruikelijke molaire verhoudingen voor ligatie

Bij de meeste standaardkloneringsreacties met kleverige, overhangende uiteinden wordt een insert:vector-verhouding van 3:1 gebruikt. Ligaties waarbij stompe uiteinden worden gekoppeld, zijn minder efficiënt, waardoor een hogere verhouding, zoals 5:1, gebruikelijk is. Zeer grote inserts werken soms beter met een lagere verhouding, dichter bij 1:1, omdat grote fragmenten per molecuul al veel baseparen bevatten.

Veelgestelde vragen

Wat is DNA-ligatie?

DNA-ligatie is het samenvoegen van twee DNA-fragmenten, meestal een plasmidevector en een insert, tot één continu molecuul. Het enzym T4-DNA-ligase maakt de verbinding tussen de uiteinden van de fragmenten dicht.

Wat betekent de molaire insert:vector-verhouding?

Het is het aantal insert-DNA-moleculen dat per vectormolecuul in de reactie aanwezig is. Een verhouding van 3:1 betekent drie insertmoleculen per vectormolecuul, ongeacht hoe hun massa's zich tot elkaar verhouden.

Waarom worden geen gelijke hoeveelheden vector en insert in nanogram gebruikt?

DNA-fragmenten met verschillende lengtes hebben per molecuul verschillende massa's. Een insert van 1 kb weegt per molecuul ongeveer een derde van een vector van 3 kb. Gelijke hoeveelheden in nanogram zouden dus geen gelijke aantallen moleculen opleveren, waardoor de calculator de insertmassa aanpast aan de gewenste molaire verhouding.

Wat betekent het als het totale volume te klein is?

Dit betekent dat de vector- en insertvolumes op zichzelf al het volledige reactievolume vullen, waardoor er geen ruimte overblijft voor buffer of ligase. De oplossing is het totale reactievolume te vergroten of meer geconcentreerde DNA-voorraden te gebruiken.

Kan deze calculator worden gebruikt voor Gibson Assembly of Golden Gate-klonering?

Nee. Bij deze methoden wordt een andere reactietechniek gebruikt en wordt meestal gestreefd naar equimolaire hoeveelheden van alle fragmenten in plaats van een vaste insert:vector-verhouding. De volumeberekeningen verschillen van die voor standaardklonering met T4-ligase.

Hoeveel vector-DNA wordt doorgaans gebruikt?

50 ng is een gebruikelijke starthoeveelheid voor een standaardligatiereactie. Laboratoria gebruiken ook hoeveelheden van 25 tot 100 ng, aangepast aan de DNA-concentratie en de schaal van de reactie.