Seriële Verdunning Calculator - Laboratorium Concentratie Tool

Een seriële verdunningscalculator bepaalt de concentratie van een stof bij elke stap van een verdunningsreeks. Een seriële verdunning is een laboratoriumtechniek waarbij de concentratie van een oplossing in een reeks gelijke stappen wordt verlaagd, waarbij elke nieuwe stap de voorgaande met dezelfde factor verdunt.

Wat is een seriële verdunning?

Een seriële verdunning lost een veelvoorkomend laboratoriumprobleem op: een monster is te geconcentreerd om rechtstreeks te meten of te gebruiken. In plaats van in één stap een zeer klein, foutgevoelig volume te proberen meten, verdunt een wetenschapper het monster meerdere keren achter elkaar, met bij elke stap een klein en hanteerbaar volume.

Elke verdunning begint met het resultaat van de voorgaande stap, niet met het oorspronkelijke monster. Zo ontstaat een reeks concentraties die telkens met dezelfde factor afnemen. De techniek wordt gebruikt om bacteriën te tellen, te testen hoe een geneesmiddel cellen bij verschillende doses beïnvloedt, kalibratiecurven voor laboratoriumassays op te stellen en DNA-monsters voor PCR te bereiden.

Formule voor seriële verdunning

Voor elke verdunningsstap geldt de volgende formule:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ is de concentratie vóór de stap
• DF is de verdunningsfactor
• C₂ is de concentratie na de stap

Gebruik de volgende formule om de concentratie na meerdere stappen in één keer te bepalen:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ is de beginconcentratie
• DF is de verdunningsfactor
• n is het aantal stappen
• C_n is de concentratie na n stappen

De verdunningsfactor moet groter zijn dan 1. Een factor van 1 zou helemaal geen verdunning betekenen. De beginconcentratie moet groter zijn dan 0.

Deze calculator accepteert van 1 tot 20 stappen en vermeldt daarnaast stap 0, het onverdunde monster. De concentratie-eenheid is een gewoon tekstlabel, zoals mg/mL of CFU/mL, en elke rij wordt in dezelfde eenheid weergegeven. Concentraties worden met zes significante cijfers weergegeven; waarden onder 0,000001 worden in wetenschappelijke notatie weergegeven, zodat een klein resultaat nooit als nul wordt weergegeven.

Verdunningsfactor versus verdunningsverhouding

Een verdunningsfactor van 10 wordt vaak geschreven als een verhouding van 1:10. De verhouding beschrijft hoeveelheden, niet de factor zelf: 1 deel monster plus 9 delen verdunningsmiddel geeft 10 totale delen. De factor geeft aan hoeveel keer minder geconcentreerd de nieuwe oplossing is. Een verhouding van 1:10 komt dus overeen met een verdunningsfactor van 10, niet van 11.

Veelgebruikte verdunningsfactoren zijn:

• 10 (1:10): de standaardkeuze in de microbiologie, omdat hiermee in weinig stappen een groot concentratiebereik wordt bestreken.
• 2 (1:2): gebruikelijk in de farmacologie, waar kleinere stappen nodig zijn om een dosis-responscurve uit te zetten.
• 5 (1:5): een tussenoptie, die meer datapunten oplevert dan 1:10 zonder zoveel stappen als 1:2.

Voorbeeld: een bacteriecultuur verdunnen

Een vloeibare cultuur bevat naar schatting 10⁸ kolonievormende eenheden (CFU) per milliliter, en is te dicht om rechtstreeks te tellen. Voor het tellen zijn tussen 30 en 300 kolonies per plaat nodig. Het monster vereist daarom een reeks met een verdunning van 1:10 in 6 stappen.

Door 100 μL (0,1 mL) van stap 5 uit te platen, komen er ongeveer 10² = 100 CFU op de plaat, binnen het telbare bereik.

Voorbeeld: een tweevoudige geneesmiddelverdunningsreeks

Naar verwachting heeft een geneesmiddel een IC50 (de concentratie die de activiteit met de helft vermindert) van ongeveer 25 mg/mL. Om een bereik rond die waarde te testen, is een reeks met een verdunning van 1:2 nodig, beginnend bij 100 mg/mL en met 5 stappen.

Deze reeks omvat de verwachte IC50 en levert voldoende punten op om een dosis-responscurve uit te zetten.

Een seriële verdunning uitvoeren

1. Label elke buis vóór het begin met het stapnummer en de verdunningsfactor.
2. Voeg aan elke buis verdunningsmiddel toe, behalve aan de buis met het oorspronkelijke monster. Voeg bij een reeks met 1:10 9 volumes verdunningsmiddel toe aan 1 volume dat het monster zal bevatten.
3. Breng een afgemeten volume van het oorspronkelijke monster over in de eerste buis en meng grondig, bijvoorbeeld door te vortexen of meerdere keren op en neer te pipetteren.
4. Breng met een nieuwe pipettip hetzelfde volume over van de eerste naar de tweede buis en meng opnieuw.
5. Herhaal het overbrengen en mengen voor elke resterende buis.
6. Gebruik de verdunde monsters zo snel mogelijk, omdat levende cellen blijven groeien en sommige verbindingen na verloop van tijd afbreken.

Toepassingen van seriële verdunning

In de microbiologie wordt seriële verdunning gebruikt voor het tellen van bacteriekolonies op platen en voor het testen van de minimale remmende concentratie (MIC), de laagste antibioticadosis die de bacteriegroei stopt. In de biochemie wordt de techniek gebruikt om standaardcurven voor eiwitassays op te stellen en om DNA-matrijzen voor PCR met een werkbare concentratie te bereiden. In de farmacologie worden verdunningsreeksen gebruikt om geneesmiddelen over een bereik van doses te testen en waarden zoals IC50 te berekenen. In de immunologie worden ze gebruikt voor ELISA-kalibratiecurven en voor antilichaamtitratie, waarbij de hoogste verdunning wordt vastgesteld die nog een positief resultaat geeft.

Veelvoorkomende fouten

Slecht mengen van elke buis is een veelvoorkomende foutbron, omdat deeltjes en cellen kunnen bezinken in plaats van gelijkmatig verspreid te blijven. Hergebruik van een pipettip kan voldoende materiaal uit een meer geconcentreerde buis meenemen om latere metingen te verstoren. Verwarring tussen de verdunningsverhouding en de verdunningsfactor leidt tot verkeerde volumes: een verdunning van 1:10 betekent 1 deel monster plus 9 delen verdunningsmiddel, niet 1 deel plus 10. Als bij elke stap een concentratie wordt afgerond in plaats van de eindwaarde rechtstreeks te berekenen met C₀/DF^n, kan zich over meerdere stappen een merkbare fout opstapelen.

Geschiedenis

Robert Koch ontwikkelde in de 1880s kwantitatieve methoden om bacteriekolonies te tellen tijdens zijn onderzoek naar tuberculose en cholera. Daarmee legde hij de basis voor de plaat telmethode die nog steeds wordt gebruikt. De luchtverplaatsingsmicropipet, uitgevonden door Heinrich Schnitger in 1957, maakte het later mogelijk microlitervolumes nauwkeurig te meten. Daardoor werden fijne, reproduceerbare verdunningsreeksen praktisch uitvoerbaar voor de moleculaire biologie en immunoassays.

Veelgestelde vragen

Hoe berekent men een seriële verdunning? Gebruik C_n = C₀ / DF^n, waarbij C₀ de beginconcentratie is, DF de verdunningsfactor en n het aantal stappen. Een verdunning van 100 mg/mL met een factor van 10 over 3 stappen geeft bijvoorbeeld 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Wat is het verschil tussen de verdunningsfactor en de verdunningsverhouding? De verdunningsverhouding, zoals 1:10, beschrijft delen: 1 deel monster gemengd met 9 delen verdunningsmiddel geeft 10 totale delen. De verdunningsfactor is het getal 10 zelf, wat betekent dat de oplossing tien keer minder geconcentreerd is.

Waarom meerdere kleine verdunningsstappen gebruiken in plaats van één grote verdunning? Kleine overdrachten met gelijke volumes zijn nauwkeuriger te pipetteren dan één zeer grote verdunning. Een reeks van zes stappen met 1:10 bereikt ook een miljoenvoudige verdunning, een bereik dat in één stap moeilijk nauwkeurig te realiseren is.

Hoe nauwkeurig is een seriële verdunning? Met gekalibreerde pipetten en een zorgvuldige techniek is een reeks doorgaans nauwkeurig binnen 5 tot 10 procent, wat geschikt is voor de meeste microbiologische werkzaamheden. Toepassingen die een hogere nauwkeurigheid vereisen, zoals farmaceutische standaarden, gebruiken vaak parallelle verdunningen die rechtstreeks vanuit de voorraadoplossing worden gemaakt.

Wat is het maximaal zinvolle aantal verdunningsstappen? Deze calculator staat maximaal 20 stappen toe. De meeste laboratoriumprotocollen gebruiken 6 tot 10 stappen, omdat de fout bij elke extra overdracht toeneemt. Een grotere verdunningsfactor vermindert het benodigde aantal stappen; drie stappen van 1:100 bereiken bijvoorbeeld dezelfde verdunning van 10⁻⁶ als zes stappen van 1:10.

Kan de verdunningsfactor tussen stappen in dezelfde reeks veranderen? Ja, maar in de meeste protocollen blijft de factor constant, omdat een vaste factor eenvoudiger te berekenen, te pipetteren en te reproduceren is. Een variabele reeks wordt soms gebruikt wanneer voor een deel van het concentratiebereik een fijnere resolutie nodig is dan voor een ander deel.