qPCR Efficiëntie Calculator: Standaardcurve Analyse Tool

qPCR-efficiëntiecalculator

Een qPCR-efficiëntiecalculator schat hoe goed een kwantitatieve PCR-reactie (qPCR) tijdens elke amplificatiecyclus de doel-DNA-sequentie kopieert. De calculator gebruikt Ct-waarden (het cyclusnummer waarop het fluorescentiesignaal een ingestelde drempel overschrijdt) uit een verdunningsreeks om de efficiëntie, richtingscoëfficiënt, het snijpunt en R² te berekenen.

Wat is qPCR-efficiëntie?

Kwantitatieve PCR volgt de fluorescentie terwijl een reactie een doel-DNA-sequentie cyclus voor cyclus kopieert. De amplificatie-efficiëntie beschrijft hoeveel de hoeveelheid doel-DNA per cyclus toeneemt. Bij een efficiëntie van 100% verdubbelt de hoeveelheid doel-DNA tijdens elke cyclus.

In echte reacties wordt precies 100% zelden bereikt. De meeste laboratoria beschouwen een efficiëntie tussen 90% en 110% als aanvaardbaar voor betrouwbare kwantificatie. Een waarde lager dan 90% of hoger dan 110% wijst op een probleem, zoals een slecht primerontwerp, PCR-remmers die bij de monstervoorbewerking zijn overgebleven of pipetteerfouten in de verdunningsreeks.

Efficiëntie is vooral belangrijk bij het vergelijken van genexpressie tussen monsters. De gebruikelijke ΔΔCt-methode voor het berekenen van de vouwverandering gaat ervan uit dat elke reactie een efficiëntie van 100% heeft. Wanneer de gemeten efficiëntie afwijkt van 100%, of wanneer een doelgen en een referentiegen verschillende efficiënties hebben, kunnen de resultaten van de vouwverandering onnauwkeurig zijn.

Formule voor qPCR-efficiëntie

De efficiëntie wordt berekend uit de helling van de standaardcurve, een lijn die ontstaat door Ct-waarden uit te zetten tegen de logaritme met grondtal 10 (log10) van de hoeveelheid start-DNA in een verdunningsreeks.

E = 10^(-1/helling) - 1

E is de efficiëntie, uitgedrukt als decimaal getal (vermenigvuldig met 100 voor het percentage). De helling is de helling van de standaardcurve. Deze is negatief, omdat de Ct-waarde stijgt naarmate de hoeveelheid start-DNA afneemt.

Een helling van -3,32 komt overeen met een efficiëntie van 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Dit klopt omdat een 10-voudige verdunning de Ct-waarde met ongeveer 3,32 cycli zou moeten verschuiven als de reactie het DNA tijdens elke cyclus verdubbelt, aangezien log2(10) ongeveer 3,32 is.

In de praktijk wordt een helling tussen -3,1 en -3,6 als aanvaardbaar beschouwd. Dit bereik komt overeen met een efficiëntie van ongeveer 90% tot 110%. Een helling dichter bij -3,1 geeft een hogere berekende efficiëntie; een helling dichter bij -3,6 geeft een lagere efficiëntie.

qPCR-efficiëntie berekenen: de standaardcurvemethode

1. Maak een verdunningsreeks. Begin met het meest geconcentreerde monster en verdun dit voor elk volgend monster met een vaste factor, meestal 10-voudig. Voer qPCR uit op elke verdunning en noteer de Ct-waarde.
2. Zet elke verdunning om in een log10-waarde. Als het eerste, meest geconcentreerde monster de positie 0 krijgt, is voor monsternummer i de log10 (relatieve hoeveelheid) gelijk aan -i × log10(verdunningsfactor).
3. Zet voor elke verdunning Ct (verticale as) uit tegen de log10-waarde (horizontale as) en voer een lineaire regressie uit.
4. Lees de richtingscoëfficiënt, het snijpunt en de R² van de regressielijn af.
5. Vul de helling in in E = 10^(-1/helling) - 1 om de efficiëntie te berekenen.

Kwaliteitscriteria voor de standaardcurve

• R² van ten minste 0,98. Dit meet hoe goed de punten op een rechte lijn passen. Een lagere waarde wijst vaak op pipetteerfouten of inconsistente amplificatie.
• Helling tussen -3,1 en -3,6. Dit bereik komt overeen met een efficiëntie van 90–110%.
• Ten minste drie verdunningspunten. Vijf of zes punten leveren een betrouwbaardere lijn op en maken het gemakkelijker een uitschieter te herkennen.
• Het meest geconcentreerde monster zou een Ct-waarde rond 15-20 moeten geven. Het meest verdunde monster moet onder Ct 35 blijven, omdat waarden daarboven de detectielimiet naderen.

Uitgewerkt voorbeeld

Een vijfpuntsverdunningsreeks met een 10-voudige verdunning geeft de volgende Ct-waarden, van meest naar minst geconcentreerd: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

De waarden voor log10 (relatieve hoeveelheid) zijn 0, -1, -2, -3, -4, omdat elke verdunningsstap -log10(10), oftewel -1, toevoegt. De Ct-waarde stijgt bij elke stap met 3,5 cycli, waardoor de punten op een rechte lijn liggen en de lineaire regressie het volgende geeft:

• Helling: -3,5
• Intercept: 15,0
• R²: 1,0

Efficiëntie: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, oftewel ongeveer 93%.

Een efficiëntie van 93% met R² = 1,0 voldoet aan de standaardkwaliteitscriteria en is geschikt voor kwantificatie van genexpressie.

Codevoorbeeld

Deze JavaScript-functie volgt dezelfde methode als de calculator. De index van elke Ct-waarde wordt negatief gemaakt voordat de logaritme wordt berekend, omdat het eerste, meest geconcentreerde monster de hoogste relatieve hoeveelheid heeft en elk volgend monster verder verdund is.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Waarom efficiëntie belangrijk is voor genexpressie

Berekeningen van vouwverandering, waaronder de ΔΔCt-methode, gaan ervan uit dat elke reactie het doel tijdens elke cyclus verdubbelt. Wanneer een doelgen en een referentiegen verschillende gemeten efficiënties hebben, introduceert de gewone ΔΔCt-formule een fout. Onderzoekers stappen dan vaak over op een efficiëntiegecorrigeerde berekening, zoals de methode die Michael Pfaffl in 2001 beschreef, wanneer de efficiënties meer dan ongeveer vijf procentpunten verschillen. De MIQE-richtlijnen, een veel geciteerde reeks rapportagestandaarden voor qPCR die in 2009 is gepubliceerd, bevelen aan dat onderzoeken naast de kwantificatieresultaten ook de berekende efficiëntie, helling en R² rapporteren.

Veelgestelde vragen

Wat is een goed efficiëntiepercentage voor qPCR?

Een waarde tussen 90% en 110% wordt over het algemeen aanvaard, waarbij goed geoptimaliseerde assays rond 95–105% uitkomen. Een helling van -3,32 komt overeen met precies 100%.

Waarom ligt mijn qPCR-efficiëntie boven 110%?

Veelvoorkomende oorzaken zijn pipetteerfouten bij het maken van de verdunningsreeks, primerdimeren, remstoffen die monsters met een hoge en lage concentratie ongelijkmatig beïnvloeden, of een fluorescentiedrempel die buiten de exponentiële amplificatiefase is ingesteld. Een smeltcurve met meer dan één piek kan wijzen op primerdimeren.

Waarom ligt mijn qPCR-efficiëntie onder 90%?

Waarschijnlijke oorzaken zijn een slecht primerontwerp, PCR-remmers die bij de monstervoorbewerking zijn overgebleven of een niet-optimale hybridisatietemperatuur. Controle van de primerspecificiteit en het uitvoeren van een temperatuurgradiënt kunnen helpen de oorzaak te vinden.

Wat betekent een lage R²-waarde?

R² meet hoe goed de Ct-waarden op een rechte lijn passen tegen de logaritme van de hoeveelheid. Een waarde onder 0,98 wijst op inconsistente pipettering, een geremd monster of een verdunningspunt in de buurt van de detectielimiet.

Hoeveel verdunningspunten heeft een standaardcurve nodig?

Ten minste drie, het minimum dat nodig is voor een lineaire regressie. Vijf of zes punten leveren een betrouwbaardere helling op en maken het gemakkelijker uitschieters te herkennen.

Kan de efficiëntie tussen experimenten veranderen?

Ja. Een nieuwe reagenspartij, een nieuwe primerbatch, een ander monstertype of een ander qPCR-instrument kan de efficiëntie veranderen. Veel laboratoria controleren de efficiëntie om de paar maanden opnieuw of bij elke nieuwe reagenspartij.

Referenties

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. De MIQE-richtlijnen: minimale informatie voor publicatie van kwantitatieve realtime-PCR-experimenten. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Een nieuw wiskundig model voor relatieve kwantificatie in realtime-RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Hoe goed is een schatting van de PCR-efficiëntie: aanbevelingen voor nauwkeurige en betrouwbare qPCR-efficiëntiebeoordelingen. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.