DNA Hybridiseringstemperatur Kalkulator | Gratis PCR Tm Verktøy

Hva er en kalkulator for annealingtemperatur for DNA?

En kalkulator for annealingtemperatur for DNA anslår smeltetemperaturen (Tm) til en DNA-primer ut fra sekvensen. Tm er temperaturen der halvparten av primermolekylene er bundet til måltråden sin, mens den andre halvparten ikke er det. I en polymerasekjedereaksjon (PCR) angir denne verdien temperaturen som brukes for at primerne skal feste seg til DNA-templatet.

Hvorfor annealingtemperaturen er viktig i PCR

PCR kopierer et målsegment av DNA gjennom gjentatte oppvarmings- og avkjølingssykluser. Hver syklus har tre trinn. Først separerer oppvarming det dobbelttrådede templatet ved omtrent 95 °C. Dette trinnet kalles denaturering. Deretter avkjøles reaksjonen til annealingtemperaturen, vanligvis mellom 50 °C og 65 °C, slik at korte primere kan binde seg til samsvarende sekvenser på enkelttrådene. Til slutt stiger temperaturen til omtrent 72 °C, og et enzym kalt DNA-polymerase forlenger primerne for å bygge nye DNA-tråder.

Hvis annealingtemperaturen er for lav, binder primerne seg til sekvenser som bare delvis samsvarer, og det dannes ekstra, uønskede DNA-fragmenter. Hvis den er for høy, kan primerne ikke danne en stabil binding til templatet, og lite eller ikke noe DNA blir kopiert. Annealingtemperaturen er en av de første innstillingene forskere justerer når en PCR-reaksjon mislykkes.

Hvordan GC-innhold påvirker Tm

En primer pares med målsekvensen gjennom hydrogenbindinger. Et guanin-cytosin-par (G-C) danner tre hydrogenbindinger. Et adenin-tymin-par (A-T) danner to. En primer med flere G- og C-baser trenger mer varme for å separeres, og har derfor høyere Tm enn en like lang primer med flere A- og T-baser. GC-innhold oppgis vanligvis som en prosentandel: antallet G- og C-baser dividert på den totale sekvenslengden, multiplisert med 100.

Formel for annealingtemperatur for DNA

Denne kalkulatoren bruker én av to formler, valgt ut fra primerlengden.

For primere på 14 nukleotider eller mer bruker den Marmur-Doty-formelen for GC-innhold:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Her er N_GC antallet G- og C-baser i primeren, telt direkte og ikke som en prosentandel. N er det totale antallet baser.

For primere som er kortere enn 14 nukleotider, bruker den Wallace-regelen:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G og C står hver for antallet av den aktuelle basen i primeren.

Begge formlene forutsetter vanlige PCR-betingelser: omtrent 50 nanomolar primer og 50 millimolar Na+.

Regneeksempel

Ta primeren på 19 baser ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Lengden er 19, som er 14 eller mer, så kalkulatoren bruker Marmur-Doty-formelen.

• Lengde (N) = 19
• G-antall = 5, C-antall = 5, så N_GC = 10, og GC-innholdet er 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formelen bruker GC-antallet, 10, ikke GC-prosenten, 52,6. Hvis prosentandelen brukes ved en feil, blir Tm nær 143 °C, noe som ikke er en realistisk verdi for en PCR-reaksjon som kjøres mellom 50 °C og 95 °C.

Slik bruker du denne kalkulatoren

Skriv inn eller lim inn en primersekvens som bare bruker bokstavene A, T, G og C. Kalkulatoren viser sekvenslengden i nukleotider (nt), GC-innholdet som en prosentandel og den beregnede annealingtemperaturen i grader Celsius. Resultatet kan kopieres til laboratorienotater eller en protokoll.

Valg av annealingtemperatur for PCR

Tm er et beregnet anslag, ikke en garantert fungerende temperatur. Mange PCR-protokoller starter det faktiske annealingtrinnet noen grader under den beregnede Tm-en og justerer ut fra resultatet på en gel. For et primerpar brukes normalt den laveste av de to primerens Tm-verdier som utgangspunkt. Gradient-PCR, der flere reaksjoner kjøres samtidig over et temperaturområde, er en vanlig måte å finne den beste temperaturen på ved å teste seg fram.

Andre måter å anslå Tm på

Marmur-Doty- og Wallace-formlene som brukes her, er raske tilnærminger som bare er basert på basesammensetningen. Det finnes andre metoder:

• Termodynamikk basert på nærmeste naboer tar hensyn til hvordan hvert par av nabobaser påvirker stabiliteten, og regnes som den mer nøyaktige metoden for standardprimere.
• Saltjusterte formler legger til en korreksjon for konsentrasjonen av Na+- eller K+-ioner i reaksjonsbufferen, siden høyere saltkonsentrasjon stabiliserer DNA-dobbeltråden og øker Tm.

Ulike kalkulatorer kan rapportere forskjellige Tm-verdier for samme primer fordi de bruker forskjellige formler. Å kjøre PCR-en og kontrollere resultatet er fortsatt den endelige testen.

Ofte stilte spørsmål

Hva er annealingtemperatur for DNA?

Det er temperaturen der DNA-primere binder seg til den samsvarende sekvensen på en templattråd under PCR. Laboratorier setter den vanligvis noen grader under primerens beregnede smeltetemperatur (Tm).

Hvordan beregnes Tm for en primer?

For primere på 14 baser eller mer er Tm = 64,9 + 41 × (GC-antall − 16,4) / lengde. For primere som er kortere enn 14 baser, er Tm = 2 × (A+T-antall) + 4 × (G+C-antall).

Hvorfor øker GC-innholdet Tm?

G-C-basepar danner tre hydrogenbindinger, sammenlignet med to for A-T-par. En primer med en større andel G- og C-baser trenger mer energi, og dermed høyere temperatur, for å separeres fra målsekvensen.

Bør PCR-ens annealingtemperatur være lik den beregnede Tm-en?

Nei. De fleste protokoller starter flere grader under den beregnede Tm-en og justerer derfra, fordi Tm angir punktet der bare halvparten av primeren er bundet.

Endrer primerlengden Tm?

Ja, men ikke på en enkel måte. Lengden står i nevneren i Marmur-Doty-formelen, så en lengre primer med gjennomsnittlig GC-innhold får ikke automatisk høyere Tm enn en kortere, GC-rik primer.

Hvorfor er ikke ulike Tm-kalkulatorer enige?

De bruker forskjellige formler. Wallace-regelen, Marmur-Doty-formelen for GC-innhold, termodynamikk basert på nærmeste naboer og saltjusterte formler kan hver gi en forskjellig Tm for samme primer, noen ganger med flere graders forskjell.

Referanser

1. Marmur J, Doty P. Bestemmelse av basesammensetningen i deoksyribonukleinsyre ut fra den termiske denatureringstemperaturen. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridisering av syntetiske oligodeoksyribonukleotider med phi chi 174 DNA. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. En samlet fremstilling av termodynamikken for nærmeste naboer i polymer-, dumbbell- og oligonukleotid-DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.