Kalkulator Ligacji DNA - Oblicz Współczynniki Wstawki:Wektora dla Klonowania Molekularnego

Ligacja DNA to etap klonowania molekularnego, w którym fragment inserta jest łączony z wektorem plazmidowym za pomocą enzymu ligazy DNA T4. Kalkulator ligacji DNA oblicza, ile mikrolitrów DNA inserta i DNA wektora należy zmieszać, aby w reakcji uzyskać wybrany stosunek molowy inserta do wektora.

Działanie kalkulatora

Kalkulator przyjmuje sześć danych wejściowych: stężenie wektora, długość wektora, stężenie inserta, długość inserta, docelowy stosunek molowy inserta do wektora oraz całkowitą objętość reakcji. Umożliwia także ustawienie ilości używanego DNA wektora, której domyślna wartość wynosi 50 nanogramów (ng). Na podstawie tych wartości oblicza objętość wektora do odpipetowania, objętość inserta do odpipetowania oraz ilość buforu lub wody, którą należy dodać, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji.

Stężenie mierzy się w nanogramach na mikrolitr (ng/μL), zwykle odczytując je z aparatu Nanodrop lub Qubit. Długość mierzy się w parach zasad (bp). Jeden kilobaz (kb) odpowiada 1000 par zasad. Stosunek molowy określa, ile cząsteczek inserta powinno przypadać na jedną cząsteczkę wektora. Nie jest to stosunek mas.

Dlaczego stosuje się stosunek molowy, a nie masowy

Równe masy DNA nie zawierają równej liczby cząsteczek. Krótki insert waży mniej niż długi wektor przy tej samej liczbie cząsteczek. Zmieszanie równych ilości nanogramów krótkiego inserta i długiego wektora skutkowałoby zdecydowanie zbyt małą liczbą cząsteczek inserta w stosunku do liczby cząsteczek wektora. Kalkulator skaluje masę inserta według stosunku długości fragmentów, dzięki czemu końcowa mieszanina zawiera zamierzoną liczbę cząsteczek inserta na jedną cząsteczkę wektora.

Wzór na ligację DNA

Wymagana ilość DNA inserta, wyrażona w nanogramach, wynosi:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

gdzie $m_i$ oznacza ilość insertu w nanogramach, $m_v$ — ilość wektora w nanogramach, $k_i$ — długość insertu w kilozasadach, $k_v$ — długość wektora w kilozasadach, a R — docelowy stosunek molowy insertu do wektora.

Po ustaleniu tej ilości kalkulator przelicza każdą ilość na objętość możliwą do odpipetowania:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

gdzie $V_v$ i $V_i$ oznaczają odpowiednio objętości wektora i insertu w mikrolitrach, $c_v$ i $c_i$ — odpowiednio stężenia wektora i insertu w nanogramach na mikrolitr, $V_b$ oznacza objętość buforu, a $V_t$ — całkowitą objętość reakcji.

Jeśli łączna objętość wektora i inserta jest większa niż całkowita objętość reakcji, nie pozostaje miejsca na bufor, ligazę ani wodę. W takim przypadku kalkulator zgłasza, że całkowita objętość jest zbyt mała, zamiast wyświetlać ujemną ilość buforu.

Przykład obliczeniowy

Badacz klonuje fragment genu o długości 1 kb do wektora plazmidowego o długości 3 kb. Plan zakłada użycie 50 ng DNA wektora przy stosunku molowym inserta do wektora 3:1, w reakcji o objętości 20 μL.

Dane wejściowe:

• Stężenie wektora: 50 ng/μL
• Długość wektora: 3000 bp (3 kb)
• Stężenie inserta: 25 ng/μL
• Długość inserta: 1000 bp (1 kb)
• Stosunek molowy: 3
• Całkowita objętość: 20 μL
• Ilość wektora: 50 ng

Krok 1: ilość inserta

ng inserta = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Krok 2: objętości

Objętość wektora = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Objętość inserta = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Objętość buforu = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakcja składa się z 1 μL wektora, 2 μL inserta oraz 17 μL buforu lub wody; w tym miejscu dodaje się również ligazę i jej bufor reakcyjny. Mieszanina ta zapewnia trzy cząsteczki inserta na każdą cząsteczkę wektora.

Typowe stosunki molowe w ligacji

W większości standardowych klonowań z lepkimi, wystającymi końcami stosuje się stosunek inserta do wektora 3:1. Ligacje z tępymi końcami są mniej wydajne, dlatego często stosuje się wyższy stosunek, na przykład 5:1. W przypadku bardzo dużych insertów lepszy może być niższy stosunek, bliższy 1:1, ponieważ duże fragmenty zawierają już wiele par zasad w jednej cząsteczce.

Często zadawane pytania

Czym jest ligacja DNA?

Ligacja DNA to połączenie dwóch fragmentów DNA, zazwyczaj wektora plazmidowego i inserta, w jedną ciągłą cząsteczkę. Enzym ligaza DNA T4 uszczelnia połączenie między końcami fragmentów.

Co oznacza stosunek molowy inserta do wektora?

Jest to liczba cząsteczek DNA inserta przypadających na jedną cząsteczkę wektora w reakcji. Stosunek 3:1 oznacza trzy cząsteczki inserta na każdą cząsteczkę wektora, niezależnie od wzajemnego stosunku ich mas.

Dlaczego nie stosuje się równych ilości nanogramów wektora i inserta?

Fragmenty DNA o różnej długości mają różne masy pojedynczych cząsteczek. Insert o długości 1 kb waży w przybliżeniu jedną trzecią tego, co wektor o długości 3 kb, przy porównaniu pojedynczych cząsteczek. Równe ilości nanogramów każdego z nich nie zapewniłyby równej liczby cząsteczek, dlatego kalkulator dostosowuje masę inserta do docelowego stosunku molowego.

Co oznacza zbyt mała całkowita objętość?

Oznacza to, że same objętości wektora i inserta zajmują już całą objętość reakcji, nie pozostawiając miejsca na bufor ani ligazę. Rozwiązaniem jest zwiększenie całkowitej objętości reakcji lub użycie bardziej stężonych roztworów wyjściowych DNA.

Czy tego kalkulatora można używać do klonowania metodami Gibson Assembly lub Golden Gate?

Nie. Metody te wykorzystują inną chemię reakcji i zwykle wymagają równomolowych ilości wszystkich fragmentów, a nie ustalonego stosunku inserta do wektora. Obliczenia objętości różnią się od obliczeń dla standardowego klonowania z użyciem ligazy T4.

Ile DNA wektora zazwyczaj się stosuje?

50 ng to często stosowana ilość wyjściowa w standardowej reakcji ligacji. W laboratoriach stosuje się również ilości od 25 do 100 ng, dostosowane do stężenia DNA i skali reakcji.