Oblicz optymalne objętości reakcji ligacji DNA, wprowadzając stężenia wektora i insercji, długości oraz stosunki molowe. Niezbędne narzędzie w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej.
Ligi DNA to kluczowa technika biologii molekularnej używana do łączenia fragmentów DNA razem za pomocą wiązań kowalencyjnych. Kalkulator Ligi DNA to niezbędne narzędzie dla badaczy, które pomaga określić optymalne ilości DNA wektora i wstawki potrzebne do udanych reakcji ligacji. Obliczając odpowiednie stosunki molowe między DNA wektora (plazmidu) a fragmentami DNA wstawki, ten kalkulator zapewnia efektywne eksperymenty klonowania molekularnego, minimalizując marnotrawstwo odczynników i nieudane reakcje.
Reakcje ligacji są fundamentem inżynierii genetycznej, biologii syntetycznej i procedur klonowania molekularnego. Pozwalają naukowcom tworzyć rekombinowane cząsteczki DNA poprzez wstawianie genów interesujących do plazmidów wektorowych w celu późniejszej transformacji do organizmów gospodarzy. Sukces tych reakcji w dużej mierze zależy od użycia odpowiednich ilości komponentów DNA, co dokładnie pomaga określić ten kalkulator.
Niezależnie od tego, czy tworzysz wektory ekspresyjne, tworzysz biblioteki genowe, czy przeprowadzasz rutynowe subklonowanie, ten kalkulator ligacji DNA pomoże Ci zoptymalizować warunki eksperymentalne i zwiększyć wskaźnik sukcesu. Wprowadzając kilka kluczowych parametrów dotyczących próbek DNA, możesz szybko uzyskać dokładne objętości potrzebne do konkretnej reakcji ligacji.
Kalkulator ligacji DNA wykorzystuje podstawowy wzór biologii molekularnej, który uwzględnia różne rozmiary i stężenia fragmentów DNA, które mają być połączone. Podstawowe obliczenie określa, ile DNA wstawki jest potrzebne w stosunku do DNA wektora, w oparciu o ich odpowiednie długości i pożądany stosunek molowy.
Ilość potrzebnego DNA wstawki (w nanogramach) oblicza się za pomocą następującego wzoru:
Gdzie:
Gdy wymagana ilość DNA wstawki zostanie określona, oblicza się potrzebne objętości do reakcji:
Przejdźmy przez praktyczny przykład:
Krok 1: Oblicz wymaganą ilość wstawki
Krok 2: Oblicz objętości
To obliczenie zapewnia, że w reakcji znajduje się trzy cząsteczki wstawki na każdą cząsteczkę wektora, co optymalizuje szanse na udaną ligację.
Nasz kalkulator ligacji DNA został zaprojektowany w sposób intuicyjny i prosty. Wykonaj następujące kroki, aby obliczyć optymalne objętości dla swojej reakcji ligacji:
Wprowadź Informacje o Wektorze:
Wprowadź Informacje o Wstawce:
Ustaw Parametry Reakcji:
Wyświetl Wyniki:
Skopiuj Wyniki (opcjonalnie):
Kalkulator wykonuje kontrole walidacyjne, aby upewnić się, że wszystkie dane wejściowe są dodatnimi liczbami oraz że całkowita objętość jest wystarczająca dla wymaganych objętości DNA. Jeśli wykryte zostaną jakiekolwiek błędy, pomocne komunikaty o błędach pomogą Ci poprawić dane wejściowe.
Kalkulator ligacji DNA jest cenny w wielu zastosowaniach biologii molekularnej:
Najczęstsze zastosowanie to standardowe klonowanie molekularne, w którym badacze wstawiają geny lub fragmenty DNA do plazmidów wektorowych. Kalkulator zapewnia optymalne warunki dla:
W biologii syntetycznej, gdzie często składa się wiele fragmentów DNA:
Podczas opracowywania narzędzi diagnostycznych molekularnych:
Dla badaczy pracujących nad produkcją białek:
W zastosowaniach edycji genomu:
Kalkulator jest szczególnie cenny w trudnych scenariuszach ligacji:
Podczas gdy nasz kalkulator ligacji DNA zapewnia precyzyjne obliczenia dla tradycyjnych reakcji ligacji, istnieje kilka alternatywnych podejść do łączenia fragmentów DNA:
Gibson Assembly: Używa egzonukleazy, polimerazy i ligazy w jednej reakcji, aby połączyć nakładające się fragmenty DNA. Nie są potrzebne tradycyjne obliczenia ligacji, ale stosunki stężeń są nadal ważne.
Golden Gate Assembly: Używa enzymów restrykcyjnych typu IIS do kierunkowego, bezszwowego łączenia wielu fragmentów. Wymaga równomolowych ilości wszystkich fragmentów.
SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Używa egzonukleazy do tworzenia pojedynczo-niciowych nawisów, które się ze sobą łączą. Zazwyczaj używa równomolowych stosunków fragmentów.
In-Fusion Cloning: Komercyjny system, który pozwala na łączenie fragmentów z 15 bp nakładkami. Używa specyficznego stosunku w oparciu o rozmiary fragmentów.
Gateway Cloning: Używa rekombinacji specyficznej dla miejsca zamiast ligacji. Wymaga specyficznych wektorów wejściowych i docelowych.
Testowanie Empiryczne: Niektóre laboratoria wolą ustawić wiele reakcji ligacyjnych z różnymi stosunkami wstawka:wektor (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) i określić, który działa najlepiej dla ich konkretnych konstrukcji.
Kalkulatory Oprogramowania: Komercyjne pakiety oprogramowania, takie jak Vector NTI i SnapGene, zawierają kalkulatory ligacji z dodatkowymi funkcjami, takimi jak analiza miejsc restrykcyjnych.
Rozwój obliczeń ligacji DNA pokrywa się z ewolucją technik klonowania molekularnego, które zrewolucjonizowały biologię molekularną i biotechnologię.
Koncepcja ligacji DNA do klonowania molekularnego pojawiła się na początku lat 70. XX wieku dzięki pionierskiej pracy Paula Berga, Herberta Boyera i Stanleya Cohena, którzy opracowali pierwsze cząsteczki DNA rekombinowanego. W tym okresie reakcje ligacji były w dużej mierze empiryczne, a badacze używali prób i błędów, aby określić optymalne warunki.
Odkrycie enzymów restrykcyjnych i ligazy DNA dostarczyło niezbędnych narzędzi do cięcia i ponownego łączenia cząsteczek DNA. Ligaza DNA T4, izolowana z E. coli zakażonej bakteriofagiem T4, stała się standardowym enzymem do łączenia fragmentów DNA dzięki swojej zdolności do ligacji zarówno końców płaskich, jak i kohezynowych.
W miarę jak klonowanie molekularne stało się bardziej rutynowe, badacze zaczęli opracowywać bardziej systematyczne podejścia do reakcji ligacji. Znaczenie stosunków molowych między DNA wektora a wstawką stało się oczywiste, co doprowadziło do opracowania podstawowego wzoru, który jest nadal używany dzisiaj.
W tym okresie badacze ustalili, że nadmiar DNA wstawki (zazwyczaj w stosunku molowym 3:1 do 5:1) zazwyczaj poprawia wydajność ligacji w standardowych zastosowaniach klonowania. Ta wiedza była początkowo dzielona w protokołach laboratoryjnych i stopniowo trafiała do podręczników i podręczników biologii molekularnej.
Pojawienie się narzędzi komputerowych i kalkulatorów online w latach 2000 umożliwiło bardziej dostępne precyzyjne obliczenia ligacji dla badaczy. W miarę jak techniki biologii molekularnej stawały się coraz bardziej wyrafinowane, potrzeba dokładnych obliczeń stała się bardziej krytyczna, szczególnie w przypadku trudnych projektów klonowania, które obejmowały wiele fragmentów lub duże wstawki.
Dziś obliczenia ligacji DNA są integralną częścią procesów klonowania molekularnego, a dedykowane kalkulatory, takie jak ten, pomagają badaczom optymalizować swoje eksperymenty. Podstawowy wzór pozostał w dużej mierze niezmieniony, chociaż nasze zrozumienie czynników wpływających na wydajność ligacji poprawiło się.
Pojawienie się alternatywnych metod klonowania, takich jak Gibson Assembly i Golden Gate cloning, wprowadziło nowe potrzeby obliczeniowe, ale podstawowa koncepcja stosunków molowych między fragmentami DNA pozostaje ważna w tych technikach.
Oto implementacje kalkulatora ligacji DNA w różnych językach programowania:
1' Funkcja VBA Excel dla Kalkulatora Ligi DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3 ' Oblicz wymaganą ilość wstawki w ng
4 CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8 ' Oblicz objętość wektora w μL
9 CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13 ' Oblicz objętość wstawki w μL
14 CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18 ' Oblicz objętość buforu/wody w μL
19 CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Przykład użycia w komórce:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
241def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration,
2 insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3 """
4 Oblicz objętości dla reakcji ligacji DNA.
5
6 Parametry:
7 vector_concentration (float): Stężenie DNA wektora w ng/μL
8 vector_length (float): Długość DNA wektora w parach zasad
9 insert_concentration (float): Stężenie DNA wstawki w ng/μL
10 insert_length (float): Długość DNA wstawki w parach zasad
11 molar_ratio (float): Pożądany stosunek molowy wstawka:wektor
12 total_volume (float): Całkowita objętość reakcji w μL
13 vector_amount (float): Ilość DNA wektora do użycia w ng (domyślnie: 50)
14
15 Zwraca:
16 dict: Słownik zawierający obliczone objętości i ilości
17 """
18 # Oblicz objętość wektora
19 vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20
21 # Oblicz wymaganą ilość wstawki
22 vector_length_kb = vector_length / 1000
23 insert_length_kb = insert_length / 1000
24 insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25
26 # Oblicz objętość wstawki
27 insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28
29 # Oblicz objętość buforu/wody
30 buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31
32 return {
33 "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34 "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35 "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36 "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37 "vector_amount": vector_amount
38 }
39
40# Przykład użycia
41result = calculate_ligation_volumes(
42 vector_concentration=50,
43 vector_length=3000,
44 insert_concentration=25,
45 insert_length=1000,
46 molar_ratio=3,
47 total_volume=20
48)
49
50print(f"Wektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Wstawka: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Bufor: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Całkowita: 20 μL")
541function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration,
2 insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3 // Przekształć długości na kb do obliczeń
4 const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5 const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6
7 // Oblicz wymaganą ilość wstawki
8 const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9
10 // Oblicz objętości
11 const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12 const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13 const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14
15 return {
16 vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17 insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18 bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19 insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20 vectorAmount: vectorAmount
21 };
22}
23
24// Przykład użycia
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Wektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Wstawka: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Bufor: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Całkowita: 20 μL`);
301public class DNALigationCalculator {
2 public static class LigationResult {
3 public final double vectorVolume;
4 public final double insertVolume;
5 public final double bufferVolume;
6 public final double insertAmount;
7 public final double vectorAmount;
8
9 public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume,
10 double insertAmount, double vectorAmount) {
11 this.vectorVolume = vectorVolume;
12 this.insertVolume = insertVolume;
13 this.bufferVolume = bufferVolume;
14 this.insertAmount = insertAmount;
15 this.vectorAmount = vectorAmount;
16 }
17 }
18
19 public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20 double vectorConcentration, double vectorLength,
21 double insertConcentration, double insertLength,
22 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23
24 // Przekształć długości na kb
25 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27
28 // Oblicz wymaganą ilość wstawki
29 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30
31 // Oblicz objętości
32 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35
36 // Zaokrągl do 2 miejsc po przecinku
37 vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38 insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39 bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40 insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41
42 return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43 }
44
45 public static void main(String[] args) {
46 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47
48 System.out.printf("Wektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49 System.out.printf("Wstawka: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50 System.out.printf("Bufor: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51 System.out.printf("Całkowita: 20 μL%n");
52 }
53}
541#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6 double vectorVolume;
7 double insertVolume;
8 double bufferVolume;
9 double insertAmount;
10 double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14 double vectorConcentration, double vectorLength,
15 double insertConcentration, double insertLength,
16 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17
18 // Przekształć długości na kb
19 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21
22 // Oblicz wymaganą ilość wstawki
23 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24
25 // Oblicz objętości
26 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29
30 // Zaokrągl do 2 miejsc po przecinku
31 vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32 insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33 bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34 insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35
36 return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41
42 std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43 std::cout << "Wektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44 std::cout << "Wstawka: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45 std::cout << "Bufor: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46 std::cout << "Całkowita: 20 μL" << std::endl;
47
48 return 0;
49}
50Optymalny stosunek molowy wstawki do wektora zazwyczaj waha się od 3:1 do 5:1 dla standardowych zastosowań ligacji. Jednak może to się różnić w zależności od konkretnego scenariusza ligacji:
Kilka czynników może wpływać na wydajność ligacji poza stosunkiem molowym:
Zazwyczaj zaleca się użycie 50-100 ng DNA wektora w standardowych reakcjach ligacji. Użycie zbyt dużej ilości wektora może prowadzić do wyższego tła nieciętego lub samoligowanego wektora, podczas gdy zbyt mała ilość może zmniejszyć wydajność transformacji. W przypadku trudnych ligacji możesz potrzebować zoptymalizować tę ilość.
Tak. Ligacje końca płaskiego są zazwyczaj mniej wydajne niż ligacje końca kohezynowego. Dla ligacji końca płaskiego używaj:
Dla montażu wielu fragmentów:
Ten kalkulator jest zaprojektowany specjalnie dla tradycyjnych reakcji ligacji opartych na enzymach restrykcyjnych i ligazach. Dla Gibson Assembly zazwyczaj zaleca się równomolowe ilości wszystkich fragmentów (stosunek 1:1), chociaż podstawowe obliczenie ilości DNA w oparciu o długość jest podobne. Dla Golden Gate Assembly również zazwyczaj używa się równomolowych stosunków wszystkich komponentów.
Defosforylacja wektora (usunięcie grup 5' fosforanowych) zapobiega samoligacji, ale nie zmienia obliczeń ilości. Jednak dla defosforylowanych wektorów:
Minimalna praktyczna objętość reakcji zazwyczaj wynosi 10 μL, co pozwala na odpowiednie mieszanie i zapobiega problemom z parowaniem. Jeśli Twoje obliczone objętości DNA przekraczają pożądaną objętość reakcji, masz kilka opcji:
Optymalne czasy inkubacji różnią się w zależności od typu ligacji:
Tak, mieszanki ligacyjne można zazwyczaj przechowywać w -20°C i ponownie używać do transformacji. Jednak każda cykl zamrażania-rozmrażania może zmniejszyć wydajność. Aby uzyskać najlepsze wyniki:
Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069
Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852
Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/
New England Biolabs (NEB) - Protokół ligacji DNA. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202
Thermo Fisher Scientific - Techniczne odniesienie do klonowania molekularnego. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html
Promega - Podręcznik techniczny do klonowania. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/
Odkryj więcej narzędzi, które mogą być przydatne dla Twojego przepływu pracy