Kalkulator Liczby Kopii DNA | Narzędzie Analizy Genomicznej

Kalkulator liczby kopii DNA

Kalkulator liczby kopii DNA szacuje, ile kopii sekwencji docelowej znajduje się w próbce DNA. Wykorzystuje stężenie i objętość próbki oraz częstość występowania sekwencji docelowej w obrębie większej sekwencji DNA. Laboratoria biologii molekularnej używają takich szacunków do planowania doświadczeń, takich jak qPCR (ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy), przed wykonaniem droższego i dokładniejszego oznaczenia.

Co oznacza liczba kopii DNA

Liczba kopii DNA to liczba wystąpień określonej sekwencji w genomie lub próbce. Typowy gen człowieka występuje w dwóch kopiach, po jednej odziedziczonej od każdego z rodziców. Na tę liczbę może wpływać kilka czynników.

• Amplifikacja: więcej niż dwie kopie. Komórki nowotworowe często amplifikują geny stymulujące wzrost, takie jak HER2 w niektórych guzach piersi.
• Delecja: mniej niż dwie kopie, a czasami zero. Delecje mogą powodować choroby genetyczne.
• Duplikacja: pojawia się dodatkowa kopia tam, gdzie powinna znajdować się tylko jedna lub dwie.
• Zmienność liczby kopii (CNV): prawidłowa różnica w liczbie kopii między osobami, występująca w istotnej części ludzkiego genomu.

Wzór na liczbę kopii DNA

Kalkulator przekształca liczbę wystąpień sekwencji i masę próbki w liczbę kopii za pomocą następującego wzoru:

$\text{Liczba kopii} = \frac{\text{Wystąpienia} \times \text{Stężenie} \times \text{Objętość} \times N_A}{\text{Długość DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Gdzie:

• Wystąpienia — liczba wystąpień sekwencji docelowej w całej sekwencji DNA; nakładające się dopasowania są liczone oddzielnie.
• Stężenie — stężenie DNA w nanogramach na mikrolitr (ng/μL), zwykle odczytywane za pomocą spektrofotometru lub fluorymetru.
• Objętość — objętość próbki w mikrolitrach (μL).
• $N_A$ — liczba Avogadra, 6,022 × 10²³ cząsteczek na mol. Przelicza liczbę moli DNA na liczbę cząsteczek.
• Długość DNA — długość całej sekwencji DNA w parach zasad.
• 660 — średnia masa molowa jednej pary zasad DNA, wyrażona w gramach na mol (g/mol). Para zasad składa się z dwóch sparowanych nukleotydów, po jednym z każdej nici DNA.
• 10⁹ — przelicznik nanogramów na gramy.

Wzór najpierw przelicza masę próbki na liczbę moli cząsteczek DNA, następnie mnoży ją przez liczbę Avogadra, aby uzyskać całkowitą liczbę cząsteczek DNA w próbce, a potem mnoży przez liczbę wystąpień sekwencji docelowej w każdej cząsteczce.

Narzędzie przyjmuje wyłącznie litery A, T, C i G. Spacje i podziały wierszy są ignorowane, a małe litery są traktowane tak samo jak wielkie.

Jak obliczyć liczbę kopii DNA: przykład obliczeniowy

Rozważmy sekwencję DNA o długości 12 par zasad, ATCGATCGATCG, z sekwencją docelową ATCG, o stężeniu 10 ng/μL i objętości 20 μL.

Krok 1: Policz wystąpienia. ATCG występuje 3 razy w ATCGATCGATCG (na pozycjach 1, 5 i 9).

Krok 2: Oblicz całkowitą masę DNA. Stężenie × objętość = 10 × 20 = 200 ng.

Krok 3: Przelicz na mole. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Podziel przez (12 par zasad × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Otrzymujemy 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Krok 4: Przelicz na liczbę cząsteczek. Pomnóż przez liczbę Avogadra: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ cząsteczek/mol ≈ 1,52 × 10¹³ cząsteczek DNA.

Krok 5: Pomnóż przez liczbę wystąpień. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, czyli około 45 621 212 121 212 kopii.

Ta liczba wydaje się ogromna, ponieważ próbka o objętości 20 μL i stężeniu 10 ng/μL nadal zawiera biliony krótkich cząsteczek DNA. Rzeczywiste próbki zwykle zawierają znacznie dłuższe sekwencje, co zmniejsza liczbę cząsteczek przy tej samej masie.

Zastosowania analizy liczby kopii DNA

Diagnostyka nowotworów. Laboratoria patomorfologiczne oznaczają liczbę kopii HER2 w tkance guza piersi. Prawidłowa komórka zawiera dwie kopie. W komórce guza z amplifikacją może występować sześć lub więcej kopii, co wpływa na możliwość zastosowania leków celowanych, takich jak trastuzumab.

Badania chorób genetycznych. Choroby takie jak zespół DiGeorge'a wiążą się z delecją fragmentu chromosomu. Zespół Downa wiąże się z dodatkową kopią chromosomu 21 (trisomią 21). Liczenie kopii pomaga potwierdzić te rozpoznania.

Oznaczanie liczby kopii transgenu i plazmidu. Naukowcy sprawdzają, ile kopii wprowadzonego genu znalazło się w komórce roślinnej, zwierzęcej lub bakteryjnej. Zwykle preferowana jest pojedyncza kopia, ponieważ wiele kopii może wywołać wyciszenie genu przez komórkę.

Monitorowanie patogenów i obciążenia wirusowego. Szacunki liczby kopii określają ilość wirusowego lub bakteryjnego DNA obecnego w próbce; metoda ta jest stosowana do monitorowania zakażeń i w badaniach środowiskowych.

Inne metody pomiaru liczby kopii

Ten kalkulator szybko szacuje wynik na podstawie danych o sekwencji i stężeniu. Laboratoria wymagające większej precyzji zwykle stosują jedną z poniższych metod:

• Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR): amplifikuje i mierzy DNA w czasie rzeczywistym; przy dobrej krzywej wzorcowej zapewnia dokładność rzędu 15–20%.
• Cyfrowa reakcja PCR (dPCR): dzieli próbkę na tysiące małych reakcji, umożliwiając bezpośrednie liczenie bez potrzeby stosowania krzywej wzorcowej.
• Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH): umożliwia bezpośrednie wizualne liczenie sekwencji pod mikroskopem, w komórkach lub na chromosomach; jest standardową metodą w wielu laboratoriach diagnostyki nowotworów.
• Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS): sekwencjonuje całą próbkę i jednocześnie określa liczbę kopii w całym genomie.

Często zadawane pytania

Czym jest liczba kopii DNA? Jest to liczba wystąpień danej sekwencji DNA w genomie lub próbce. Większość genów człowieka występuje w dwóch kopiach, po jednej od każdego z rodziców. Dodatkowe lub brakujące kopie mogą wpływać na zdrowie i ryzyko chorób.

Jak dokładny jest ten kalkulator? Podaje teoretyczny szacunek na podstawie wprowadzonych danych, a nie wynik pomiaru laboratoryjnego. Dokładność zależy od precyzji pomiaru stężenia i swoistości sekwencji docelowej. Metody takie jak cyfrowa reakcja PCR są dokładniejsze w przypadku wyników publikowanych.

Czy tego kalkulatora można używać do RNA? Nie. RNA zawiera uracyl zamiast tyminy i inny cukier, dlatego jego masa cząsteczkowa różni się od masy DNA. Średnia masa cząsteczkowa RNA wynosi około 330 g/mol na nukleotyd, w porównaniu z około 660 g/mol na parę zasad DNA. Zastosowanie wzoru dla DNA do danych RNA dałoby nieprawidłowy wynik.

Dlaczego nakładająca się sekwencja jest liczona więcej niż raz? Kalkulator zlicza każdą pozycję, w której sekwencja docelowa pasuje, nawet jeśli dopasowania mają wspólne litery. W ATATAT sekwencja ATA pasuje dwukrotnie — na pozycji 1 i pozycji 3 — ponieważ każda pozycja początkowa jest sprawdzana niezależnie.

Jaki zakres stężeń DNA działa najlepiej? Stężenia 10–100 ng/μL zapewniają najbardziej wiarygodne odczyty na standardowych przyrządach laboratoryjnych. Poniżej 10 ng/μL rośnie błąd pomiaru i zamiast standardowego spektrofotometru zaleca się zastosowanie czulszej metody, takiej jak fluorymetr.

Czy ten kalkulator może oszacować liczbę kopii plazmidu? Tak. Jako sekwencję DNA wprowadź pełną sekwencję plazmidu, a jako sekwencję docelową — unikalny region wstawki, wraz ze zmierzonym stężeniem plazmidu i objętością próbki.