Kalkulator Wydajności qPCR: Narzędzie do Analizy Krzywej Standardowej

Kalkulator wydajności qPCR

Kalkulator wydajności qPCR szacuje, jak dobrze reakcja ilościowego PCR (qPCR) kopiuje docelową sekwencję DNA w każdym cyklu amplifikacji. Wykorzystuje wartości Ct (numer cyklu, w którym sygnał fluorescencji przekracza ustalony próg) z serii rozcieńczeń do obliczenia wydajności, nachylenia, wyrazu wolnego i R².

Czym jest wydajność qPCR?

Ilościowy PCR śledzi fluorescencję w miarę kopiowania docelowej sekwencji DNA przez reakcję, cykl po cyklu. Wydajność amplifikacji opisuje, jak bardzo ilość docelowego DNA zwiększa się w każdym cyklu. Przy wydajności 100% ilość docelowego DNA podwaja się w każdym cyklu.

Rzeczywiste reakcje rzadko osiągają dokładnie 100%. W większości laboratoriów wydajność między 90% a 110% uznaje się za akceptowalną dla wiarygodnej kwantyfikacji. Wartość poniżej 90% lub powyżej 110% wskazuje na problem, taki jak niewłaściwy projekt starterów, inhibitory PCR przeniesione z ekstrakcji próbki lub błędy pipetowania w serii rozcieńczeń.

Wydajność ma największe znaczenie przy porównywaniu ekspresji genów między próbkami. Powszechna metoda ΔΔCt obliczania zmiany krotności zakłada, że każda reakcja przebiega z wydajnością 100%. Gdy zmierzona wydajność różni się od 100% albo gen docelowy i gen referencyjny mają różne wydajności, wyniki zmiany krotności mogą być niedokładne.

Wzór na wydajność qPCR

Wydajność oblicza się na podstawie nachylenia krzywej standardowej, czyli prostej utworzonej przez naniesienie wartości Ct względem logarytmu o podstawie 10 (log10) ilości początkowego DNA w serii rozcieńczeń.

E = 10^(-1/nachylenie) - 1

E oznacza wydajność wyrażoną jako ułamek dziesiętny (aby uzyskać procent, należy pomnożyć przez 100). Nachylenie to nachylenie prostej krzywej standardowej. Jest ujemne, ponieważ Ct rośnie wraz ze spadkiem ilości początkowego DNA.

Nachylenie -3,32 odpowiada wydajności 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Wynika to z faktu, że rozcieńczenie 10-krotne powinno przesunąć Ct o około 3,32 cyklu, jeśli reakcja podwaja ilość DNA w każdym cyklu, ponieważ log2(10) wynosi w przybliżeniu 3,32.

W praktyce za akceptowalne uznaje się nachylenie między -3,1 a -3,6. Zakres ten odpowiada wydajności wynoszącej w przybliżeniu od 90% do 110%. Nachylenie bliższe -3,1 daje wyższą obliczoną wydajność, a nachylenie bliższe -3,6 — niższą.

Jak obliczyć wydajność qPCR: metoda krzywej standardowej

1. Przygotuj serię rozcieńczeń. Rozpocznij od próbki o najwyższym stężeniu i rozcieńczaj ją za każdym razem o stały współczynnik, zwykle 10-krotny, dla każdej kolejnej próbki. Wykonaj qPCR dla każdego rozcieńczenia i zapisz jego wartość Ct.
2. Przelicz każde rozcieńczenie na wartość log10. Uznając pierwszą, najbardziej stężoną próbkę za pozycję 0, próbka o numerze i ma log10(ilości względnej) równy -i × log10(współczynnika rozcieńczenia).
3. Dla każdego rozcieńczenia nanieś Ct (oś pionowa) względem wartości log10 (oś pozioma) i wykonaj regresję liniową.
4. Odczytaj nachylenie, wyraz wolny i R² prostej regresji.
5. Podstaw nachylenie do wzoru E = 10^(-1/nachylenie) - 1, aby uzyskać wydajność.

Kryteria jakości krzywej standardowej

• R² wynoszące co najmniej 0,98. Parametr ten mierzy, jak dobrze punkty układają się na prostej. Niższa wartość często wskazuje na błędy pipetowania lub niespójną amplifikację.
• Nachylenie między -3,1 a -3,6. Zakres ten odpowiada wydajności 90–110%.
• Co najmniej trzy punkty rozcieńczeń. Pięć lub sześć punktów daje bardziej wiarygodną prostą i ułatwia wykrycie wartości odstającej.
• Najbardziej stężona próbka powinna dawać Ct około 15-20. Wartość Ct dla najbardziej rozcieńczonej próbki powinna pozostać poniżej 35, ponieważ wartości powyżej tego poziomu zbliżają się do granicy wykrywalności.

Przykład obliczeń

Pięciopunktowa seria rozcieńczeń 10-krotnych daje następujące wartości Ct, od próbki o najwyższym do najniższego stężeniu: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Wartości log10(ilości względnej) wynoszą 0, -1, -2, -3, -4, ponieważ każdy etap rozcieńczania dodaje -log10(10), czyli -1. Ct rośnie o 3,5 cyklu na każdym etapie, więc punkty układają się na prostej, a regresja liniowa daje:

• Nachylenie: -3,5
• Wyraz wolny: 15,0
• R²: 1,0

Wydajność: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, czyli około 93%.

Wydajność 93% przy R² = 1,0 spełnia standardowe kryteria jakości i nadaje się do kwantyfikacji ekspresji genów.

Przykład kodu

Ta funkcja JavaScript stosuje tę samą metodę co kalkulator. Indeks każdej wartości Ct jest negowany przed obliczeniem logarytmu, ponieważ pierwsza, najbardziej stężona próbka ma największą ilość względną, a każda kolejna próbka jest bardziej rozcieńczona.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Dlaczego wydajność ma znaczenie w analizie ekspresji genów

Obliczenia zmiany krotności, w tym metoda ΔΔCt, zakładają, że każda reakcja podwaja ilość docelowego produktu w każdym cyklu. Gdy gen docelowy i gen referencyjny mają różne zmierzone wydajności, prosty wzór ΔΔCt wprowadza błąd. Przy różnicy wydajności większej niż około pięć punktów procentowych badacze często przechodzą na obliczenia skorygowane o wydajność, takie jak metoda opisana przez Michaela Pfaffla w 2001. Wytyczne MIQE, szeroko cytowany zbiór standardów raportowania wyników qPCR opublikowany w 2009, zalecają podawanie obliczonej wydajności, nachylenia i R² wraz z wynikami kwantyfikacji.

Najczęściej zadawane pytania

Jaki procent wydajności qPCR jest dobry?

Za ogólnie akceptowalny uznaje się zakres od 90% do 110%, a w dobrze zoptymalizowanych testach wartości wynoszą około 95–105%. Nachylenie -3,32 odpowiada dokładnie wydajności 100%.

Dlaczego wydajność mojego qPCR przekracza 110%?

Do częstych przyczyn należą błędy pipetowania w serii rozcieńczeń, dimery starterów, inhibitory, które nierównomiernie wpływają na próbki stężone i rozcieńczone, lub próg fluorescencji ustawiony poza fazą wykładniczą amplifikacji. Krzywa topnienia z więcej niż jednym pikiem może wskazywać na dimery starterów.

Dlaczego wydajność mojego qPCR jest niższa niż 90%?

Prawdopodobnymi przyczynami są niewłaściwy projekt starterów, inhibitory PCR przeniesione z ekstrakcji próbki lub nieoptymalna temperatura przyłączania starterów. Sprawdzenie swoistości starterów i wykonanie gradientu temperatury może pomóc ustalić przyczynę.

Co oznacza niska wartość R²?

R² mierzy, jak dobrze wartości Ct układają się na prostej względem ilości wyrażonej logarytmicznie. Wartość poniżej 0,98 sugeruje niespójność pipetowania, zahamowanie reakcji w próbce lub punkt rozcieńczenia znajdujący się blisko granicy wykrywalności.

Ilu punktów rozcieńczeń wymaga krzywa standardowa?

Co najmniej trzech — to minimum potrzebne do wykonania regresji liniowej. Pięć lub sześć punktów daje bardziej wiarygodne nachylenie i ułatwia wykrywanie wartości odstających.

Czy wydajność może się zmieniać między eksperymentami?

Tak. Nowa seria odczynników, nowa partia starterów, inny typ próbki lub inny aparat do qPCR mogą zmienić wydajność. Wiele laboratoriów ponownie sprawdza wydajność co kilka miesięcy lub przy każdej nowej serii odczynników.

Piśmiennictwo

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA i in. Wytyczne MIQE: informacje minimalne wymagane do publikacji eksperymentów ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Nowy model matematyczny względnej kwantyfikacji w czasie rzeczywistym RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Jak wiarygodne jest oszacowanie wydajności PCR: zalecenia dotyczące precyzyjnej i wiarygodnej oceny wydajności qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.