Kalkulator Rozcieńczeń Komórek - Dokładne Narzędzie do Rozcieńczeń Laboratoryjnych

Kalkulator rozcieńczania zawiesiny komórkowej

Kalkulator rozcieńczania zawiesiny komórkowej oblicza, ile zawiesiny komórkowej i ile rozcieńczalnika należy zmieszać, aby uzyskać docelowe stężenie komórek w wybranej objętości końcowej. Stosuje się go w hodowli komórkowej, mikrobiologii i innych pracach laboratoryjnych, w których próbkę trzeba przed użyciem doprowadzić do dokładnego stężenia.

Na czym polega rozcieńczanie zawiesiny komórkowej

Rozcieńczanie zawiesiny komórkowej nie zmienia liczby zawartych w niej komórek. Zmienia jedynie objętość cieczy, w której znajdują się komórki, przez co zmniejsza ich stężenie. Zawiesina o stężeniu 1 000 000 komórek na mililitr (komórek/ml) nadal zawiera po rozcieńczeniu tę samą całkowitą liczbę komórek. Liczba ta jest po prostu rozproszona w większej objętości cieczy.

W laboratoriach rozcieńcza się komórki przed wieloma rutynowymi czynnościami: podziałem rosnącej hodowli na nowe kolby, wysianiem określonej liczby komórek do każdego dołka płytki, zamrożeniem komórek do przechowywania lub przygotowaniem próbki do automatycznego licznika komórek albo cytometru przepływowego.

Wzór na rozcieńczanie zawiesiny komórkowej

Obliczenie opiera się na jednej zasadzie. Liczba komórek pobranych z zawiesiny wyjściowej, pomnożona przez jej stężenie, musi być równa liczbie komórek w objętości końcowej, pomnożonej przez stężenie docelowe:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — stężenie początkowe (wyjściowe), w komórkach/ml
• V₁ — objętość użytej zawiesiny wyjściowej, w ml
• C₂ — stężenie docelowe, w komórkach/ml
• V₂ — wymagana całkowita objętość końcowa, w ml

Po przekształceniu wzoru względem V₁ otrzymuje się objętość zawiesiny wyjściowej do odpipetowania:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Pozostała część objętości końcowej to rozcieńczalnik, zwykle pożywka do hodowli komórkowej, roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) lub inny bufor:

Objętość rozcieńczalnika = V₂ − V₁

Stężenie docelowe (C₂) nigdy nie może być wyższe niż stężenie wyjściowe (C₁). Rozcieńczanie tylko zmniejsza stężenie. Aby je zwiększyć, trzeba odwirować komórki i ponownie zawiesić je w mniejszej objętości cieczy.

Jak obliczyć rozcieńczenie zawiesiny komórkowej

1. Policz komórki w zawiesinie wyjściowej za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby uzyskać C₁.
2. Zapisz wymagane w protokole stężenie docelowe, C₂.
3. Ustal wymaganą całkowitą objętość końcową, V₂.
4. Oblicz V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Oblicz objętość rozcieńczalnika jako V₂ − V₁.
6. Odpipetuj V₁ zawiesiny wyjściowej do probówki, a następnie dodaj objętość rozcieńczalnika w postaci pożywki lub buforu.

Przykład obliczeniowy

W zawiesinie wyjściowej oznaczono stężenie 1 000 000 komórek/ml. Protokół wymaga stężenia 100 000 komórek/ml w objętości końcowej 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Objętość rozcieńczalnika = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Pobrano 1 mL zawiesiny wyjściowej i dodano 9 mL pożywki, uzyskując 10 mL zawiesiny o stężeniu 100 000 komórek/ml.

Drugi przykład

Test na płytce z 96 dołkami wymaga 10 000 komórek w każdym dołku, w 200 mikrolitrach (μl) pożywki na dołek. Odpowiada to stężeniu docelowemu 50 000 komórek/ml, ponieważ 10 000 komórek podzielone przez 0,2 mL daje 50 000 komórek/ml. Zawiesinę wyjściową zliczono przy stężeniu 2 000 000 komórek/ml, a do pokrycia płytki, z pewnym zapasem na straty podczas pipetowania, potrzeba łącznie 20 mL.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Objętość rozcieńczalnika = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Zmieszanie 0,5 mL zawiesiny wyjściowej z 19,5 mL pożywki daje 20 mL zawiesiny o stężeniu 50 000 komórek/ml, czyli rozcieńczenie 1 do 40.

Źródła błędów

Sam wzór jest dokładny. Błędy wynikają z liczb wprowadzonych do obliczeń.

• Błąd zliczania. Nieprawidłowa liczba komórek bezpośrednio prowadzi do nieprawidłowego rozcieńczenia. Ryzyko to zmniejsza zliczanie komórek we wszystkich czterech narożnych kwadratach siatki hemocytometru i uśrednianie wyników.
• Zbrylone komórki. Zbrylenie komórek wygląda pod mikroskopem jak jedna komórka, choć w rzeczywistości składa się z kilku, przez co zaniża pozorne stężenie.
• Zakres pipety. Pipeta używana poza określonym dla niej zakresem objętości daje niedokładne wyniki. Pipeta 1000 μL ustawiona na dozowanie 5 μL nie jest wiarygodna; należy zamiast niej użyć mniejszej pipety.
• Pomylenie jednostek. Pomieszanie jednostek komórek/ml z komórkami/μl powoduje błąd tysiąc razy za duży lub za mały.
• Martwe komórki. Zwykłe zliczanie komórek obejmuje martwe komórki, chyba że użyto barwnika do oceny żywotności, takiego jak błękit trypanu. Może to zawyżyć liczbę rzeczywiście obecnych żywych komórek.

Ograniczenia tego kalkulatora

Kalkulator odrzuca liczby, dla których nie może podać użytecznego wyniku:

• Każda wartość musi być większa od zera.
• Stężenie docelowe nie może być wyższe niż stężenie początkowe.
• Stężenie początkowe musi wynosić najwyżej 1 biliona komórek/ml (1 × 10¹²).
• Obliczona objętość zawiesiny wyjściowej musi wynosić co najmniej 0,001 mL, czyli 1 mikrolitr. Mniejszej objętości nie można dokładnie odpipetować, dlatego kalkulator prosi o wprowadzenie innych liczb. Zwykle pomaga zwiększenie objętości całkowitej.

Objętości są wyświetlane z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku, a do trzech miejsc, gdy objętość zawiesiny wyjściowej jest mniejsza niż 0,01 mL, dzięki czemu mała objętość nigdy nie jest wyświetlana jako 0,00 mL.

Często zadawane pytania

Jaki jest wzór na rozcieńczanie zawiesiny komórkowej?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, gdzie C₁ i C₂ oznaczają stężenia początkowe i docelowe, a V₁ i V₂ oznaczają objętość pobraną z zawiesiny wyjściowej oraz całkowitą objętość końcową.

Czy stężenie docelowe może być wyższe niż stężenie początkowe?

Nie. Rozcieńczanie tylko zmniejsza stężenie. Uzyskanie wyższego stężenia wymaga odwirowania komórek i ponownego zawieszenia ich w mniejszej objętości.

Jakiej cieczy używać do rozcieńczania komórek?

Pełną pożywkę hodowlaną stosuje się, gdy komórki muszą pozostać żywe przez kilka godzin lub dni, na przykład przed wysianiem na płytkę. PBS lub podobny buforowany roztwór soli fizjologicznej nadaje się do krótkich rozcieńczeń, trwających mniej więcej do 30 minut, przed dalszym przetwarzaniem komórek. Pożywkę bez surowicy stosuje się wtedy, gdy białka surowicy zakłócałyby późniejszy test.

Czy ten wzór działa w przypadku bakterii lub drożdży?

Tak. C₁V₁ = C₂V₂ stosuje się do każdej zawiesiny cząstek, w tym bakterii mierzonych w jednostkach tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml), drożdży oraz cząstek wirusowych mierzonych w jednostkach tworzących łysinki na mililitr (PFU/ml), pod warunkiem że po obu stronach równania używa się tych samych jednostek.

Czy martwe komórki należy uwzględniać przy rozcieńczaniu?

Przy wysiewaniu żywej hodowli należy uwzględniać tylko żywe komórki. Jeśli zawiesina ma żywotność 80%, jej stężenie żywych komórek wynosi 0,8 razy całkowite stężenie zliczonych komórek i właśnie tego stężenia żywych komórek należy użyć jako C₁.

Jak dokładnie przygotowywać bardzo duże rozcieńczenia?

Duże rozcieńczenia, takie jak 1 do 1000, zwykle wykonuje się w serii mniejszych etapów zwanych rozcieńczeniami szeregowymi. Trzy kolejne rozcieńczenia 1 do 10 dają łącznie rozcieńczenie 1 do 1000, a każdy etap pipetowania pozostaje w zakresie objętości zapewniającym dokładność.