Calculadora de Temperatura de Hibridização de DNA | Ferramenta Gratuita de Tm para PCR
Calcule a temperatura de hibridização ideal de PCR a partir da sequência de primers. Cálculo instantâneo de Tm usando a regra de Wallace. Ferramenta gratuita com análise de conteúdo de GC para design preciso de primers.
Calculadora de Temperatura de Hibridação de DNA
Sobre a Temperatura de Hibridação de DNA
Documentação
O que é uma calculadora de temperatura de anelamento de DNA?
Uma calculadora de temperatura de anelamento de DNA estima a temperatura de fusão (Tm) de um primer de DNA a partir de sua sequência. Tm é a temperatura na qual metade das moléculas de primer está ligada à sua fita-alvo e a outra metade não está. Em uma reação em cadeia da polimerase (PCR), esse valor orienta a temperatura usada para que os primers se liguem ao molde de DNA.
Por que a temperatura de anelamento é importante na PCR
A PCR copia um trecho-alvo de DNA por meio de ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento. Cada ciclo tem três etapas. Primeiro, o calor separa o molde de fita dupla a aproximadamente 95 °C. Essa etapa é chamada desnaturação. Segundo, a reação esfria até a temperatura de anelamento, geralmente entre 50 °C e 65 °C, para que primers curtos possam se ligar a sequências correspondentes nas fitas simples. Terceiro, a temperatura sobe para cerca de 72 °C, e uma enzima chamada DNA-polimerase estende os primers para formar novas fitas de DNA.
Se a temperatura de anelamento for muito baixa, os primers se ligam a sequências que correspondem apenas parcialmente, produzindo fragmentos extras de DNA indesejados. Se for muito alta, os primers não conseguem formar uma ligação estável com o molde, e pouco ou nenhum DNA é copiado. A temperatura de anelamento é uma das primeiras configurações que os pesquisadores ajustam quando uma reação de PCR falha.
Como o conteúdo de GC afeta a Tm
Um primer se emparelha com seu alvo por meio de ligações de hidrogênio. Um par guanina-citosina (G-C) forma três ligações de hidrogênio. Um par adenina-timina (A-T) forma duas. Um primer com mais bases G e C precisa de mais calor para se separar, portanto tem uma Tm mais alta que um primer do mesmo comprimento com mais bases A e T. O conteúdo de GC geralmente é expresso como uma porcentagem: o número de bases G e C dividido pelo comprimento total da sequência, multiplicado por 100.
Fórmula da temperatura de anelamento do DNA
Esta calculadora aplica uma de duas fórmulas, escolhida de acordo com o comprimento do primer.
Para primers com 14 nucleotídeos ou mais, ela usa a fórmula de conteúdo de GC de Marmur-Doty:
Aqui, N_GC é o número de bases G e C no primer, contado diretamente, e não como porcentagem. N é o número total de bases.
Para primers com menos de 14 nucleotídeos, ela usa a regra de Wallace:
A, T, G e C representam, cada um, a quantidade dessa base no primer.
Ambas as fórmulas pressupõem condições padrão de 50 nanomolar de primer, 50 milimolar de Na+ e pH 7,0, e o ponto de transição de 14 bases entre elas segue a mesma convenção.
Exemplo prático
Considere o primer de 19 bases ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Seu comprimento é 19, que é 14 ou mais; portanto, a calculadora usa a fórmula de Marmur-Doty.
- Comprimento (N) = 19
- Contagem de G = 5, contagem de C = 5, portanto N_GC = 10
- Conteúdo de GC = 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
- Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19
- Tm = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19
- Tm = 64,9 − 13,8
- Tm ≈ 51,1 °C
A fórmula usa a contagem de GC, 10, e não a porcentagem de GC, 52,6. Usar a porcentagem por engano produz uma Tm próxima de 143 °C, que não é um valor realista para uma reação de PCR realizada entre 50 °C e 95 °C.
Como usar esta calculadora
Digite ou cole uma sequência de primer usando apenas as letras A, T, G e C. A calculadora mostra o comprimento da sequência, o conteúdo de GC em porcentagem e a temperatura de anelamento calculada. O resultado pode ser copiado para anotações de laboratório ou para um protocolo.
Escolha da temperatura de anelamento da PCR
Tm é uma estimativa calculada, não uma temperatura de trabalho garantida. Muitos protocolos de PCR começam a etapa real de anelamento alguns graus abaixo da Tm calculada e depois fazem ajustes com base no resultado em um gel. Para um par de primers, normalmente se usa como ponto de partida o menor valor de Tm dos dois primers. A PCR em gradiente, que executa várias reações simultaneamente em uma faixa de temperaturas, é uma maneira comum de encontrar a melhor temperatura por meio de testes.
Outras formas de estimar a Tm
As fórmulas de Marmur-Doty e de Wallace usadas aqui são aproximações rápidas baseadas apenas na composição das bases. Existem outros métodos:
- A termodinâmica de vizinhos mais próximos leva em conta como cada par de bases adjacentes afeta a estabilidade. Os autores de uma ferramenta de primers muito usada a descrevem como o método preferido para oligonucleotídeos de 8 a 40 bases.
- As fórmulas ajustadas para sal adicionam uma correção para a concentração de íons Na+ ou K+ no tampão da reação, pois uma concentração maior de sal estabiliza o duplex de DNA e eleva a Tm.
Calculadoras diferentes podem informar valores de Tm diferentes para o mesmo primer porque usam fórmulas diferentes. Executar a PCR e verificar o resultado continua sendo o teste final.
Perguntas frequentes
O que é a temperatura de anelamento do DNA?
É a temperatura na qual os primers de DNA se ligam à sequência correspondente em uma fita molde durante a PCR. Os laboratórios geralmente a definem alguns graus abaixo da temperatura de fusão (Tm) calculada do primer.
Como a Tm do primer é calculada?
Para primers com 14 bases ou mais, Tm = 64,9 + 41 × (contagem de GC − 16,4) / comprimento. Para primers com menos de 14 bases, Tm = 2 × (contagem de A+T) + 4 × (contagem de G+C).
Por que o conteúdo de GC aumenta a Tm?
Os pares de bases G-C formam três ligações de hidrogênio, em comparação com duas nos pares A-T. Um primer com maior proporção de bases G e C precisa de mais energia e, portanto, de uma temperatura mais alta para se separar do alvo.
A temperatura de anelamento da PCR deve ser igual à Tm calculada?
Não. A maioria dos protocolos começa vários graus abaixo da Tm calculada e faz ajustes a partir daí, porque a Tm marca o ponto em que apenas metade do primer está ligada.
O comprimento do primer altera a Tm?
Sim, embora não de maneira simples. O comprimento aparece no denominador da fórmula de Marmur-Doty; portanto, um primer mais longo com conteúdo médio de GC não tem automaticamente uma Tm mais alta que um primer mais curto e rico em GC.
Por que calculadoras diferentes de Tm apresentam resultados divergentes?
Elas usam fórmulas diferentes. A regra de Wallace, a fórmula de conteúdo de GC de Marmur-Doty, a termodinâmica do vizinho mais próximo e as fórmulas ajustadas para sal podem produzir Tm diferentes para o mesmo primer, às vezes com vários graus de diferença.
Referências
- ROSALIND. What formula is used to calculate Melting Temperature (Tm)? Central de Conhecimento ROSALIND — a regra de Wallace para sequências com menos de 14 bases, Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) / N para as mais longas, e as premissas de 50 nM de primer, 50 mM de Na+ e pH 7,0.
- SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. PMC19045 — o modelo de vizinhos mais próximos, que soma as contribuições de cada par de bases adjacentes.
- Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research, 2007. PMC1933198 — o método de vizinhos mais próximos é o preferido para oligonucleotídeos entre 8 e 40 nt; a fórmula básica é a menos recomendada.