Calculadora de Número de Cópias de DNA | Ferramenta de Análise Genômica

Calculadora do número de cópias de DNA

Uma calculadora do número de cópias de DNA estima quantas cópias de uma sequência-alvo existem em uma amostra de DNA. Ela usa a concentração e o volume da amostra, além da frequência com que a sequência-alvo aparece dentro da sequência maior de DNA. Laboratórios de biologia molecular usam esse tipo de estimativa para planejar experimentos como a qPCR (reação em cadeia da polimerase quantitativa) antes de realizar um ensaio mais caro e preciso.

O que significa o número de cópias de DNA

O número de cópias de DNA é a quantidade de vezes que uma sequência específica aparece em um genoma ou em uma amostra. Um gene humano típico aparece duas vezes, uma herdada de cada progenitor. Vários fatores podem alterar essa quantidade.

• Amplificação: mais de duas cópias. Células cancerosas frequentemente amplificam genes que promovem o crescimento, como HER2 em alguns tumores de mama.
• Deleção: menos de duas cópias, às vezes nenhuma. Deleções podem causar doenças genéticas.
• Duplicação: uma cópia adicional aparece onde deveria haver apenas uma ou duas.
• Variação do número de cópias (CNV): uma diferença normal no número de cópias entre indivíduos, encontrada em uma parcela significativa do genoma humano.

Fórmula do número de cópias de DNA

A calculadora transforma as ocorrências da sequência e a massa da amostra em uma contagem de cópias usando esta fórmula:

$\text{Número de cópias} = \frac{\text{Ocorrências} \times \text{Concentração} \times \text{Volume} \times N_A}{\text{Comprimento do DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Onde:

• Ocorrências — quantas vezes a sequência-alvo aparece na sequência completa de DNA, contando separadamente as correspondências sobrepostas.
• Concentração — concentração de DNA em nanogramas por microlitro (ng/μL), geralmente obtida com um espectrofotômetro ou fluorômetro.
• Volume — volume da amostra em microlitros (μL).
• $N_A$ — número de Avogadro, 6,022 × 10²³ moléculas por mol. Ele converte a quantidade de DNA em mols em uma contagem de moléculas.
• Comprimento do DNA — comprimento da sequência completa de DNA, em pares de bases.
• 660 — massa molecular média de um par de bases de DNA, em gramas por mol (g/mol). Um par de bases é formado por dois nucleotídeos pareados, um de cada fita de DNA.
• 10⁹ — converte nanogramas em gramas.

A fórmula primeiro converte a massa da amostra em mols de moléculas de DNA, multiplica pelo número de Avogadro para obter o número total de moléculas de DNA na amostra e, em seguida, multiplica pela quantidade de vezes que a sequência-alvo ocorre em cada molécula.

A ferramenta aceita apenas as letras A, T, C e G. Espaços e quebras de linha são ignorados, e letras minúsculas têm o mesmo valor que letras maiúsculas.

Como calcular o número de cópias de DNA: exemplo resolvido

Considere uma sequência de DNA com 12 pares de bases, ATCGATCGATCG, com uma sequência-alvo de ATCG, concentração de 10 ng/μL e volume de 20 μL.

Etapa 1: Conte as ocorrências. ATCG aparece 3 vezes em ATCGATCGATCG, nas posições 1, 5 e 9.

Etapa 2: Encontre a massa total de DNA. Concentração × volume = 10 × 20 = 200 ng.

Etapa 3: Converta para mols. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Divida por (12 pares de bases × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Isso resulta em 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Etapa 4: Converta para a contagem de moléculas. Multiplique pelo número de Avogadro: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ moléculas/mol ≈ 1,52 × 10¹³ moléculas de DNA.

Etapa 5: Multiplique pelas ocorrências. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, ou aproximadamente 45.621.212.121.212 cópias.

Esse número parece enorme porque uma amostra de 20 μL a 10 ng/μL ainda contém trilhões de moléculas curtas de DNA. As amostras reais geralmente usam sequências muito mais longas, o que reduz a contagem de moléculas para a mesma massa.

Onde a análise do número de cópias de DNA é usada

Diagnóstico de câncer. Laboratórios de patologia verificam o número de cópias de HER2 em tecido de tumor de mama. Uma célula normal possui duas cópias. Um tumor amplificado pode possuir seis ou mais, o que afeta a elegibilidade para medicamentos direcionados, como o trastuzumabe.

Testes para doenças genéticas. Condições como a síndrome de DiGeorge envolvem a deleção de um segmento cromossômico. A síndrome de Down envolve uma cópia adicional do cromossomo 21 (trissomia 21). A contagem de cópias ajuda a confirmar esses diagnósticos.

Quantificação de transgenes e plasmídeos. Pesquisadores verificam quantas cópias de um gene inserido foram incorporadas a uma célula vegetal, animal ou bacteriana. Geralmente, prefere-se uma única cópia, porque várias cópias podem levar a célula a silenciar o gene.

Monitoramento de patógenos e carga viral. As estimativas do número de cópias indicam quanto DNA viral ou bacteriano está presente em uma amostra, sendo usadas no monitoramento de infecções e em testes ambientais.

Outros métodos para medir o número de cópias

Esta calculadora fornece uma estimativa rápida a partir de dados de sequência e concentração. Laboratórios que precisam de maior precisão geralmente usam um destes métodos:

• PCR quantitativa (qPCR): amplifica e mede o DNA em tempo real; apresenta precisão de aproximadamente 15–20% com uma boa curva-padrão.
• PCR digital (dPCR): divide uma amostra em milhares de reações minúsculas para realizar a contagem direta, sem precisar de uma curva-padrão.
• Hibridização fluorescente in situ (FISH): conta visualmente as sequências ao microscópio, diretamente nas células ou nos cromossomos; é o método padrão em muitos laboratórios de diagnóstico de câncer.
• Sequenciamento de nova geração (NGS): sequencia toda a amostra e determina o perfil do número de cópias em todo o genoma de uma só vez.

Perguntas frequentes

O que é o número de cópias de DNA? É a quantidade de vezes que uma determinada sequência de DNA aparece em um genoma ou em uma amostra. A maioria dos genes humanos aparece duas vezes, uma vez por progenitor. Cópias adicionais ou ausentes podem afetar a saúde e o risco de doenças.

Qual é a precisão desta calculadora? Ela fornece uma estimativa teórica com base nos dados informados, não uma medição laboratorial. A precisão depende de quão precisamente a concentração foi medida e de quão específica é a sequência-alvo. Métodos como a PCR digital são mais precisos para resultados publicados.

Esta calculadora pode ser usada para RNA? Não. O RNA usa uracila em vez de timina e possui um açúcar diferente, portanto sua massa molecular difere da do DNA. O RNA tem uma massa molecular média de cerca de 330 g/mol por nucleotídeo, em comparação com cerca de 660 g/mol por par de bases de DNA. Usar a fórmula de DNA em dados de RNA produziria uma resposta incorreta.

Por que uma sequência sobreposta é contada mais de uma vez? A calculadora conta cada posição em que o alvo corresponde, mesmo quando as correspondências compartilham letras. Em ATATAT, a sequência ATA corresponde duas vezes, nas posições 1 e 3, porque cada posição inicial é verificada de forma independente.

Qual faixa de concentração de DNA funciona melhor? Concentrações de 10–100 ng/μL fornecem as leituras mais confiáveis em instrumentos laboratoriais padrão. Abaixo de 10 ng/μL, o erro de medição aumenta, e recomenda-se um método mais sensível, como um fluorômetro, em vez de um espectrofotômetro padrão.

Esta calculadora pode estimar o número de cópias de plasmídeos? Sim. Insira a sequência completa do plasmídeo como sequência de DNA e uma região exclusiva do inserto como sequência-alvo, juntamente com a concentração medida do plasmídeo e o volume da amostra.