Calculator Temperatură de Hibridizare ADN | Instrument Gratuit Tm PCR

Ce este un calculator al temperaturii de hibridizare a ADN-ului?

Un calculator al temperaturii de hibridizare a ADN-ului estimează temperatura de topire (Tm) a unui primer ADN pe baza secvenței sale. Tm este temperatura la care jumătate dintre moleculele de primer sunt legate de catena lor țintă, iar cealaltă jumătate nu este. Într-o reacție de polimerizare în lanț (PCR), această valoare ghidează alegerea temperaturii folosite pentru atașarea primerilor la matrița de ADN.

De ce contează temperatura de hibridizare în PCR

PCR copiază o regiune țintă de ADN prin cicluri repetate de încălzire și răcire. Fiecare ciclu are trei etape. Mai întâi, încălzirea separă matrița bicatenară la aproximativ 95 °C. Această etapă se numește denaturare. Apoi, reacția se răcește până la temperatura de hibridizare, de obicei între 50 °C și 65 °C, astfel încât primerii scurți să se poată lega de secvențele complementare de pe catenele monocatenare. În a treia etapă, temperatura crește până la aproximativ 72 °C, iar o enzimă numită ADN-polimerază extinde primerii pentru a forma noi catene de ADN.

Dacă temperatura de hibridizare este prea scăzută, primerii se leagă de secvențe care se potrivesc doar parțial, producând fragmente suplimentare de ADN nedorite. Dacă este prea ridicată, primerii nu pot forma o legătură stabilă cu matrița, iar cantități mici sau deloc de ADN sunt copiate. Temperatura de hibridizare este una dintre primele setări pe care cercetătorii le ajustează atunci când o reacție PCR eșuează.

Cum afectează conținutul GC valoarea Tm

Un primer se asociază cu ținta sa prin legături de hidrogen. O pereche guanină-citozină (G-C) formează trei legături de hidrogen. O pereche adenină-timină (A-T) formează două. Un primer cu mai multe baze G și C necesită mai multă căldură pentru a se separa, astfel că are o valoare Tm mai mare decât un primer de aceeași lungime cu mai multe baze A și T. Conținutul GC este de obicei exprimat ca procent: numărul bazelor G și C împărțit la lungimea totală a secvenței, înmulțit cu 100.

Formula temperaturii de hibridizare a ADN-ului

Acest calculator aplică una dintre cele două formule, aleasă în funcție de lungimea primerului.

Pentru primerii de 14 nucleotide sau mai lungi, utilizează formula conținutului GC Marmur-Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Aici, N_GC este numărul bazelor G și C din primer, numărate direct, nu ca procent. N este numărul total de baze.

Pentru primerii mai scurți de 14 nucleotide, utilizează regula Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G și C reprezintă fiecare numărul bazelor respective din primer.

Ambele formule presupun condiții PCR obișnuite: aproximativ 50 nanomolari de primer și 50 milimolari de Na+.

Exemplu de calcul

Luați primerul de 19 baze ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Lungimea sa este 19, adică 14 sau mai mare, astfel că calculatorul utilizează formula Marmur-Doty.

• Lungime (N) = 19
• Numărul de G = 5, numărul de C = 5, deci N_GC = 10, iar conținutul GC este 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formula utilizează numărul bazelor GC, 10, nu procentul GC, 52,6. Utilizarea din greșeală a procentului produce o valoare Tm de aproximativ 143 °C, nerealistă pentru o reacție PCR care se desfășoară între 50 °C și 95 °C.

Cum se utilizează acest calculator

Introduceți sau lipiți o secvență de primer folosind numai literele A, T, G și C. Calculatorul afișează lungimea secvenței în nucleotide (nt), conținutul GC ca procent și temperatura de hibridizare calculată în grade Celsius. Rezultatul poate fi copiat în notițele de laborator sau într-un protocol.

Alegerea temperaturii de hibridizare pentru PCR

Tm este o estimare calculată, nu o temperatură de lucru garantată. Multe protocoale încep etapa efectivă de hibridizare cu câteva grade sub valoarea Tm calculată, apoi ajustează temperatura pe baza rezultatului observat pe gel. Pentru o pereche de primeri, ca punct de pornire se folosește de obicei valoarea Tm mai mică dintre cele două. Un PCR cu gradient, care efectuează simultan mai multe reacții la temperaturi dintr-un interval, este o metodă obișnuită de găsire a temperaturii optime prin testare.

Alte metode de estimare a Tm

Formulele Marmur-Doty și Wallace utilizate aici sunt aproximări rapide bazate doar pe compoziția bazelor. Există și alte metode:

• Termodinamica vecinului apropiat ține cont de modul în care fiecare pereche de baze adiacente afectează stabilitatea și este considerată metoda mai exactă pentru primerii standard.
• Formulele corectate în funcție de concentrația de sare adaugă o corecție pentru concentrația ionilor Na+ sau K+ din tamponul de reacție, deoarece o concentrație mai mare de sare stabilizează duplexul de ADN și crește valoarea Tm.

Calculatoare diferite pot raporta valori Tm diferite pentru același primer, deoarece utilizează formule diferite. Efectuarea PCR și verificarea rezultatului rămân testul final.

Întrebări frecvente

Ce este temperatura de hibridizare a ADN-ului?

Este temperatura la care primerii ADN se leagă de secvența lor complementară de pe o catenă matriță în timpul PCR. În laboratoare, temperatura este stabilită de obicei cu câteva grade sub temperatura de topire (Tm) calculată a primerului.

Cum se calculează Tm-ul unui primer?

Pentru primerii de 14 baze sau mai lungi, Tm = 64,9 + 41 × (numărul bazelor GC − 16,4) / lungime. Pentru primerii mai scurți de 14 baze, Tm = 2 × (numărul bazelor A+T) + 4 × (numărul bazelor G+C).

De ce crește conținutul GC valoarea Tm?

Perechile de baze G-C formează trei legături de hidrogen, față de două în cazul perechilor A-T. Un primer cu o proporție mai mare de baze G și C necesită mai multă energie și, prin urmare, o temperatură mai ridicată pentru a se separa de ținta sa.

Temperatura de hibridizare PCR trebuie să fie egală cu valoarea Tm calculată?

Nu. Majoritatea protocoalelor încep cu câteva grade sub valoarea Tm calculată și ajustează de acolo, deoarece Tm marchează punctul în care doar jumătate din primer este legată.

Lungimea primerului modifică valoarea Tm?

Da, deși nu într-un mod simplu. Lungimea se află la numitorul formulei Marmur-Doty, astfel că un primer mai lung, cu un conținut GC mediu, nu are automat o valoare Tm mai mare decât un primer mai scurt, bogat în GC.

De ce nu sunt de acord calculatoarele Tm?

Ele utilizează formule diferite. Regula Wallace, formula conținutului GC Marmur-Doty, termodinamica vecinului apropiat și formulele corectate în funcție de concentrația de sare pot da fiecare o valoare Tm diferită pentru același primer, uneori cu diferențe de câteva grade.

Referințe

1. Marmur J, Doty P. Determinarea compoziției bazelor acidului dezoxiribonucleic pe baza temperaturii sale de denaturare termică. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hibridizarea oligodeoxiribonucleotidelor sintetice cu ADN phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. O perspectivă unificată asupra termodinamicii vecinilor cei mai apropiați din ADN-ul polimeric, în formă de halteră și oligonucleotidic. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.