Calculator Număr Copii ADN | Instrument de Analiză Genomică

Calculator pentru numărul de copii de ADN

Un calculator pentru numărul de copii de ADN estimează câte copii ale unei secvențe-țintă există într-o probă de ADN. Acesta folosește concentrația probei, volumul acesteia și frecvența cu care secvența-țintă apare în secvența mai lungă de ADN. Laboratoarele de biologie moleculară folosesc acest tip de estimare pentru a planifica experimente precum qPCR (reacția de polimerizare în lanț cantitativă) înainte de efectuarea unei analize mai costisitoare și mai precise.

Ce înseamnă numărul de copii de ADN

Numărul de copii de ADN reprezintă numărul de apariții ale unei secvențe specifice într-un genom sau într-o probă. O genă umană obișnuită apare de două ori, o dată moștenită de la fiecare părinte. Mai multe lucruri pot modifica acest număr.

• Amplificare: mai mult de două copii. Celulele canceroase amplifică adesea genele care stimulează creșterea, precum HER2 în unele tumori mamare.
• Deleție: mai puțin de două copii, uneori niciuna. Delețiile pot provoca tulburări genetice.
• Duplicație: apare o copie suplimentară acolo unde ar trebui să existe doar una sau două.
• Variație a numărului de copii (CNV): diferență normală a numărului de copii între indivizi, prezentă într-o parte semnificativă a genomului uman.

Formula numărului de copii de ADN

Calculatorul transformă aparițiile secvenței și masa probei într-un număr de copii folosind această formulă:

$\text{Numărul de copii} = \frac{\text{Apariții} \times \text{Concentrație} \times \text{Volum} \times N_A}{\text{Lungimea ADN-ului} \times 660 \times 10^{9}}$

Unde:

• Apariții — numărul de apariții ale secvenței-țintă în secvența completă de ADN, numărând separat potrivirile suprapuse.
• Concentrație — concentrația ADN-ului în nanograme pe microlitru (ng/μL), citită de obicei cu un spectrofotometru sau un fluorometru.
• Volum — volumul probei în microlitri (μL).
• $N_A$ — numărul lui Avogadro, 6,022 × 10²³ molecule pe mol. Acesta transformă cantitatea de ADN exprimată în moli într-un număr de molecule.
• Lungimea ADN-ului — lungimea secvenței complete de ADN, exprimată în perechi de baze.
• 660 — masa molară medie a unei perechi de baze ADN, în grame pe mol (g/mol). O pereche de baze este formată din două nucleotide asociate, câte una de pe fiecare catenă de ADN.
• 10⁹ — transformă nanogramele în grame.

Formula transformă mai întâi masa probei în moli de molecule de ADN, o înmulțește cu numărul lui Avogadro pentru a obține numărul total de molecule de ADN din probă, apoi îl înmulțește cu numărul de apariții ale secvenței-țintă în fiecare moleculă.

Instrumentul acceptă doar literele A, T, C și G. Spațiile și întreruperile de linie sunt ignorate, iar literele mici sunt considerate identice cu majusculele.

Cum se calculează numărul de copii de ADN: exemplu rezolvat

Se consideră o secvență de ADN de 12 perechi de baze, ATCGATCGATCG, cu o secvență-țintă de ATCG, o concentrație de 10 ng/μL și un volum de 20 μL.

Pasul 1: Numărarea aparițiilor. ATCG apare de 3 ori în ATCGATCGATCG (la pozițiile 1, 5 și 9).

Pasul 2: Determinarea masei totale de ADN. Concentrație × volum = 10 × 20 = 200 ng.

Pasul 3: Conversia în moli. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Se împarte la (12 perechi de baze × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Rezultatul este 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Pasul 4: Conversia în număr de molecule. Se înmulțește cu numărul lui Avogadro: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molecule/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molecule de ADN.

Pasul 5: Înmulțirea cu numărul de apariții. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, adică aproximativ 45.621.212.121.212 copii.

Acest număr pare enorm deoarece o probă de 20 μL la 10 ng/μL conține totuși trilioane de molecule scurte de ADN. Probele reale folosesc de obicei secvențe mult mai lungi, ceea ce reduce numărul de molecule pentru aceeași masă.

Unde se utilizează analiza numărului de copii de ADN

Diagnosticul cancerului. Laboratoarele de anatomie patologică verifică numărul de copii HER2 în țesutul tumorilor mamare. O celulă normală conține două copii. O tumoră amplificată poate conține șase sau mai multe, ceea ce influențează eligibilitatea pentru medicamente țintite precum trastuzumab.

Testarea bolilor genetice. Afecțiuni precum sindromul DiGeorge implică deleția unui segment cromozomial. Sindromul Down implică o copie suplimentară a cromozomului 21 (trisomia 21). Numărarea copiilor ajută la confirmarea acestor diagnostice.

Cuantificarea transgenelor și plasmidelor. Cercetătorii verifică câte copii ale unei gene inserate au fost introduse într-o celulă vegetală, animală sau bacteriană. De obicei este preferată o singură copie, deoarece copiile multiple pot determina celula să inactiveze gena.

Monitorizarea agenților patogeni și a încărcăturii virale. Estimările numărului de copii urmăresc cantitatea de ADN viral sau bacterian prezentă într-o probă, fiind utilizate pentru monitorizarea infecțiilor și testarea mediului.

Alte metode de măsurare a numărului de copii

Acest calculator oferă o estimare rapidă pe baza datelor despre secvență și concentrație. Laboratoarele care au nevoie de o precizie mai mare folosesc de obicei una dintre următoarele metode:

• PCR cantitativă (qPCR): amplifică și măsoară ADN-ul în timp real; are o precizie de aproximativ 15–20% cu o curbă standard adecvată.
• PCR digitală (dPCR): împarte proba în mii de reacții minuscule pentru numărare directă, fără a necesita o curbă standard.
• Hibridizarea in situ prin fluorescență (FISH): numără vizual secvențele la microscop, direct în celule sau cromozomi; este metoda standard în multe laboratoare de diagnostic al cancerului.
• Secvențiere de nouă generație (NGS): secvențiază întreaga probă și determină simultan profilul numărului de copii la nivelul întregului genom.

Întrebări frecvente

Ce este numărul de copii de ADN? Este numărul de apariții ale unei anumite secvențe de ADN într-un genom sau într-o probă. Majoritatea genelor umane apar de două ori, câte una de la fiecare părinte. Copiile suplimentare sau lipsă pot afecta sănătatea și riscul de boală.

Cât de precis este acest calculator? Acesta oferă o estimare teoretică pe baza datelor introduse, nu o măsurătoare de laborator. Precizia depinde de exactitatea cu care a fost măsurată concentrația și de specificitatea secvenței-țintă. Pentru rezultate publicate, metode precum PCR digitală sunt mai precise.

Poate fi utilizat acest calculator pentru ARN? Nu. ARN-ul conține uracil în loc de timină și un alt tip de zahăr, astfel încât masa sa moleculară diferă de cea a ADN-ului. ARN-ul are o masă moleculară medie de aproximativ 330 g/mol per nucleotidă, comparativ cu aproximativ 660 g/mol per pereche de baze ADN. Utilizarea formulei pentru ADN în cazul datelor despre ARN ar produce un rezultat incorect.

De ce este numărată de mai multe ori o secvență suprapusă? Calculatorul numără fiecare poziție în care secvența-țintă se potrivește, chiar dacă potrivirile au litere comune. În ATATAT, secvența ATA se potrivește de două ori, la poziția 1 și la poziția 3, deoarece fiecare poziție de început este verificată independent.

Ce interval de concentrație a ADN-ului funcționează cel mai bine? Concentrațiile de 10–100 ng/μL oferă cele mai fiabile citiri pe instrumentele standard de laborator. Sub 10 ng/μL, eroarea de măsurare crește, iar în locul unui spectrofotometru standard se recomandă o metodă mai sensibilă, precum fluorometria.

Poate acest calculator să estimeze numărul de copii ale unei plasmide? Da. Se introduce secvența completă a plasmidei ca secvență de ADN și o regiune unică a insertului ca secvență-țintă, împreună cu concentrația măsurată a plasmidei și volumul probei.