Калькулятор разведения клеток

Калькулятор разведения клеток определяет, сколько клеточной суспензии и разбавителя нужно смешать, чтобы получить заданную концентрацию клеток в выбранном конечном объёме. Его используют в клеточной культуре, микробиологии и других лабораторных работах, где перед использованием образец необходимо довести до точной концентрации.

Что означает разведение клеток

Разведение клеточной суспензии не изменяет содержащегося в ней количества клеток. Оно изменяет только объём жидкости, в котором находятся клетки, и тем самым снижает концентрацию. В суспензии, для которой измерена концентрация 1 000 000 клеток на миллилитр (клеток/мл), после разведения сохраняется то же общее количество клеток. Просто теперь оно распределено в большем объёме жидкости.

В лабораториях клетки разбавляют перед многими стандартными процедурами: пересевом растущей культуры в новые флаконы, внесением фиксированного количества клеток в каждую лунку планшета, замораживанием клеток для хранения или подготовкой образца для счётчика клеток либо проточного цитометра.

Формула разведения клеток

Расчёт основан на одном правиле. Количество взятых из исходной суспензии клеток, умноженное на её концентрацию, должно быть равно количеству клеток в конечном объёме, умноженному на заданную концентрацию:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — исходная концентрация, в клетках/мл
V₁ — объём исходной суспензии, который необходимо взять, в мл
C₂ — заданная концентрация, в клетках/мл
V₂ — требуемый общий конечный объём, в мл

Решение относительно V₁ даёт объём исходной суспензии, который нужно отобрать пипеткой:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Остальной объём составляет разбавитель — обычно питательная среда для клеточной культуры, фосфатно-солевой буфер (PBS) или другой буфер:

Объём разбавителя = V₂ − V₁

Заданная концентрация (C₂) не может быть выше исходной концентрации (C₁). Разведение только снижает концентрацию. Для её повышения клетки необходимо осадить центрифугированием и ресуспендировать в меньшем объёме жидкости.

Как рассчитать разведение клеток

Подсчитайте клетки в исходной суспензии с помощью гемоцитометра или автоматического счётчика клеток, чтобы получить C₁.
Укажите требуемую протоколом заданную концентрацию C₂.
Определите необходимый общий конечный объём V₂.
Рассчитайте V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Рассчитайте объём разбавителя как V₂ − V₁.
Отберите пипеткой V₁ исходной суспензии в пробирку, затем добавьте рассчитанный объём среды или буфера.

Пример расчёта

В исходной суспензии измерена концентрация 1 000 000 клеток/мл. Согласно протоколу требуется концентрация 100 000 клеток/мл в конечном объёме 10 мл.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 мл

Объём разбавителя = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 мл

Взятие 1 мл исходной суспензии и добавление 9 мл среды дают 10 мл суспензии с концентрацией 100 000 клеток/мл.

Второй пример

Для анализа в планшете на 96 лунок требуется 10 000 клеток на лунку и 200 микролитров (μL) среды на лунку. Это соответствует заданной концентрации 50 000 клеток/мл, поскольку деление 10 000 клеток на 0,2 мл даёт 50 000 клеток/мл. Концентрация в исходной суспензии составляет 2 000 000 клеток/мл, а для заполнения планшета с небольшим запасом на потери при пипетировании требуется 20 мл.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 мл

Объём разбавителя = 20 − 0,5 = 19,5 мл

Смешивание 0,5 мл исходной суспензии с 19,5 мл среды даёт 20 мл суспензии с концентрацией 50 000 клеток/мл и разведением 1 к 40.

Источники ошибок

Сама формула точна. Ошибки возникают из-за введённых в неё чисел.

Ошибка подсчёта. Неверный подсчёт клеток напрямую приводит к неверному разведению. Этот риск снижается, если подсчитать все четыре угловых квадрата сетки гемоцитометра и усреднить результаты.
Слипшиеся клетки. Скопление клеток выглядит под микроскопом как одна клетка, хотя на самом деле состоит из нескольких, поэтому измеренная концентрация оказывается заниженной.
Диапазон пипетки. Пипетка, используемая за пределами указанного для неё диапазона объёмов, даёт неточные результаты. Пипетка вместимостью 1000 μL, настроенная на отбор 5 μL, ненадёжна; вместо неё следует использовать пипетку меньшего объёма.
Ошибки в единицах. Смешение клеток/мл и клеток/мкл приводит к ошибке, в тысячу раз превышающей правильное значение или в тысячу раз меньшей его.
Мёртвые клетки. Обычный подсчёт клеток включает мёртвые клетки, если не использовался краситель для оценки жизнеспособности, например трипановый синий. Из-за этого количество присутствующих живых клеток может быть завышено.

Ограничения этого калькулятора

Калькулятор отклоняет значения, по которым нельзя получить полезный результат:

Каждое значение должно быть больше нуля.
Заданная концентрация не может быть выше исходной концентрации.
Исходная концентрация должна быть не выше 1 триллиона клеток/мл (1 × 10¹²).
Рассчитанный объём исходной суспензии должен быть не менее 0,001 мл, то есть 1 микролитра. Меньший объём нельзя точно отобрать пипеткой, поэтому калькулятор предлагает ввести другие значения. Обычно это исправляют увеличением общего объёма.

Объёмы отображаются с двумя знаками после запятой или с тремя, если объём исходной суспензии меньше 0,01 мл, поэтому малый объём никогда не отображается как 0,00 мл.

Часто задаваемые вопросы

Какова формула разведения клеток?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, где C₁ и C₂ — исходная и заданная концентрации, а V₁ и V₂ — объём, взятый из исходной суспензии, и общий конечный объём.

Может ли заданная концентрация быть выше исходной?

Нет. Разведение только снижает концентрацию. Для получения более высокой концентрации клетки необходимо центрифугировать и ресуспендировать в меньшем объёме.

Какую жидкость следует использовать для разведения клеток?

Полную питательную среду используют, когда клетки должны оставаться жизнеспособными в течение нескольких часов или дней, например перед внесением в планшет. PBS или аналогичный физиологический буфер подходит для кратковременного разведения, примерно до 30 минут, перед дальнейшей обработкой клеток. Бессывороточную среду используют, когда белки сыворотки могут повлиять на последующий анализ.

Подходит ли эта формула для бактерий или дрожжей?

Да. Соотношение C₁V₁ = C₂V₂ применимо к любой суспензии частиц, включая бактерии, измеряемые в колониеобразующих единицах на миллилитр (КОЕ/мл), дрожжи и вирусные частицы, измеряемые в бляшкообразующих единицах на миллилитр (БОЕ/мл), если по обе стороны уравнения используются одинаковые единицы.

Следует ли учитывать мёртвые клетки при разведении?

При посеве живой культуры следует учитывать только жизнеспособные клетки. Если жизнеспособность суспензии составляет 80 %, её жизнеспособная концентрация равна 0,8 общей концентрации клеток, и именно эту жизнеспособную концентрацию следует использовать как C₁.

Как точно выполнять очень большие разведения?

Большие разведения, например 1 к 1000, обычно выполняют серией меньших этапов, называемых последовательными разведениями. Три последовательных разведения 1 к 10 дают общее разведение 1 к 1000, при этом объём на каждом этапе пипетирования остаётся в диапазоне, обеспечивающем точность.

Калькулятор разведения клеток - точный лабораторный инструмент разведения