Калькулятор концентрации ДНК

Калькулятор концентрации ДНК преобразует показание поглощения УФ-излучения при 260 нанометрах, называемое A260, в концентрацию ДНК в нанограммах на микролитр (нг/мкл). Он также показывает общее количество ДНК в образце в микрограммах (мкг).

Что такое поглощение A260?

A260 — это количество ультрафиолетового света, которое раствор поглощает при длине волны 260 нанометров. ДНК сильнее всего поглощает УФ-свет вблизи этой длины волны из-за своих нуклеотидных оснований. Спектрофотометр измеряет A260 после измерения холостой пробы с тем же буфером, что и в образце, чтобы исключить фоновое поглощение. Чем больше ДНК в растворе, тем выше показание A260.

Формула концентрации ДНК

Двухцепочечная ДНК поглощает УФ-свет пропорционально своей концентрации; эта зависимость известна как закон Бера — Ламберта. При стандартной длине оптического пути 1 сантиметр раствор с показанием A260 1,0 содержит примерно 50 ng/мкл двухцепочечной ДНК. Это число, коэффициент пересчёта, позволяет преобразовать любое показание A260 в концентрацию:

Концентрация ДНК (нг/мкл) = A260 × 50 × коэффициент разведения

Коэффициент разведения учитывает любое разведение, выполненное до измерения образца. Для образца, измеренного без разведения, коэффициент разведения равен 1.

Как рассчитать общий выход ДНК

Зная концентрацию, общую массу ДНК в образце можно определить по его объёму:

Общее количество ДНК (мкг) = концентрация (нг/мкл) × объём (мкл) ÷ 1000

Как рассчитать концентрацию ДНК: пошаговое руководство

Перед измерением тщательно перемешайте образец. ДНК может прилипать к стенкам пробирки или неравномерно оседать.
Разведите образец, если он имеет слишком высокую концентрацию, чтобы показание A260 находилось между 0,1 и 1,0. За пределами этого диапазона показания спектрофотометра наименее надёжны.
Выполните измерение холостой пробы на спектрофотометре с тем же буфером, который использовался для разведения, затем измерьте образец при 260 нм.
Введите показание A260, объём образца и коэффициент разведения в калькулятор, чтобы получить концентрацию и общий выход. Все три поля должны быть заполнены, а объём должен быть больше нуля, прежде чем появится результат.

Пример расчёта

Пример 1: неразбавленный образец

Показание A260 равно 0,5, разведение не проводилось (коэффициент разведения 1), объём образца — 100 µL.

Концентрация = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/мкл
Общее количество ДНК = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Пример 2: разбавленный образец

В пробирке находится 50 µL очищенной ДНК. Небольшую часть образца разбавили в 10 раз, и показание A260 для разбавленной части составило 0,75. Коэффициент разведения позволяет пересчитать это показание в концентрацию исходного образца в пробирке, а объём 50 µL вводят для расчёта общего выхода.

Концентрация = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/мкл
Общее количество ДНК = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Расчёт коэффициента разведения

Коэффициент разведения = общий объём после разведения ÷ объём исходного образца.

Если добавить 5 µL раствора ДНК к 45 µL буфера, общий объём составит 50 µL, поэтому коэффициент разведения равен 50 ÷ 5 = 10. Для неразбавленного образца коэффициент разведения равен 1.

Типичные диапазоны концентрации ДНК

Концентрация зависит от типа образца и метода выделения. При выделении геномной ДНК концентрация обычно составляет примерно от 10 до 100 ng/мкл. При выделении плазмидной ДНК часто получают более высокие концентрации — иногда несколько сотен нг/мкл. Результат, значительно отклоняющийся от ожидаемого для данного метода диапазона, может указывать на проблему с выделением или самим измерением.

Ограничения измерения поглощения УФ-излучения

Измерение A260 выполняется быстро, но не является наиболее чувствительным или специфичным методом анализа ДНК. Белки, РНК и некоторые компоненты буфера также поглощают свет вблизи 260 нм и могут завышать показание. Для проверки загрязнения белками учёные часто наряду с концентрацией определяют соотношение A260/A280; значение около 1,8 обычно указывает на чистый образец ДНК. Методы на основе флуоресцентных красителей, например анализы Qubit, связываются только с двухцепочечной ДНК и дают более точные результаты для разбавленных или загрязнённых образцов, хотя требуют дополнительных реагентов и флуорометра.

Часто задаваемые вопросы

Как рассчитать концентрацию ДНК по A260?

Умножьте показание A260 на 50 — стандартный коэффициент пересчёта для двухцепочечной ДНК, — затем умножьте результат на коэффициент разведения. Если образец не разбавляли, используйте коэффициент разведения 1.

Каким должно быть соотношение A260/A280?

Значение около 1,8 обычно указывает на чистый образец ДНК. Более низкое значение указывает на загрязнение белками. Значение выше 2,0 может указывать на загрязнение РНК.

Можно ли использовать этот калькулятор для РНК?

Не напрямую, поскольку для РНК используется коэффициент пересчёта 40 ng/мкл вместо 50. Чтобы оценить концентрацию РНК, умножьте результат калькулятора на 0,8 (40 ÷ 50) или непосредственно используйте формулу A260 × 40 × коэффициент разведения.

Почему показание A260 должно находиться между 0,1 и 1,0?

Поглощение примерно пропорционально концентрации, как описывает закон Бера — Ламберта, главным образом в пределах этого диапазона. За его пределами показания становятся менее надёжными, поэтому слишком концентрированный или слишком разбавленный образец следует разбавить или концентрировать, а затем повторно измерить.

В чём разница между концентрацией и чистотой?

Концентрация показывает, сколько ДНК содержится в образце, в нг/мкл. Чистота показывает, насколько образец свободен от примесей; её оценивают главным образом по соотношениям поглощения, таким как A260/A280. Образец может иметь высокую концентрацию и при этом содержать примеси либо иметь низкую концентрацию и быть очень чистым.

Как перевести нг/мкл в мкг/мл?

Эти две единицы численно равны: 1 ng/мкл равно 1 µg/мл, поскольку единица массы и единица объёма каждая изменяются в 1000 раз.

Источники

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Калькулятор концентрации ДНК | Конвертер A260 в нг/мкл