Калькулятор эффективности ПЦР в реальном времени: Инструмент анализа стандартной кривой

Калькулятор эффективности qPCR

Калькулятор эффективности qPCR оценивает, насколько хорошо реакция количественной ПЦР (qPCR) копирует целевую последовательность ДНК в каждом цикле амплификации. Он использует значения Ct (номер цикла, на котором флуоресцентный сигнал пересекает заданный порог) для серии разведений, чтобы вычислить эффективность, наклон, точку пересечения и R².

Что такое эффективность qPCR?

Количественная ПЦР отслеживает флуоресценцию по мере того, как реакция копирует целевую последовательность ДНК от цикла к циклу. Эффективность амплификации описывает, насколько увеличивается количество целевой ДНК в каждом цикле. При эффективности 100 % количество целевой ДНК удваивается в каждом цикле.

Реальные реакции редко достигают ровно 100 %. Большинство лабораторий считают приемлемой для надёжного количественного определения эффективность от 90 % до 110 %. Значение ниже 90 % или выше 110 % указывает на проблему, например на неудачный дизайн праймеров, ингибиторы ПЦР, перенесённые из экстракта образца, или ошибки пипетирования при приготовлении серии разведений.

Эффективность наиболее важна при сравнении экспрессии генов между образцами. Распространённый метод ΔΔCt для расчёта кратности изменения предполагает, что каждая реакция проходит с эффективностью 100 %. Если измеренная эффективность отличается от 100 % или если целевой и референсный гены имеют разную эффективность, результаты расчёта кратности изменения могут быть неточными.

Формула эффективности qPCR

Эффективность рассчитывают по наклону калибровочной прямой — линии, построенной по значениям Ct в зависимости от логарифма количества исходной ДНК в серии разведений с основанием 10 (log10).

E = 10^(-1/наклон) - 1

E — эффективность, выраженная в виде десятичной дроби (для перевода в проценты умножьте на 100). Наклон — это наклон калибровочной прямой. Он отрицателен, поскольку Ct увеличивается при уменьшении количества исходной ДНК.

Наклону -3,32 соответствует эффективность 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Это объясняется тем, что десятикратное разведение 10 должно сдвигать Ct примерно на 3,32 цикла, если реакция удваивает количество ДНК в каждом цикле, поскольку log2(10) приблизительно равен 3,32.

На практике приемлемым считают наклон от -3,1 до -3,6. Этому диапазону соответствует эффективность примерно от 90 % до 110 %. Наклон, более близкий к -3,1, даёт более высокую рассчитанную эффективность; наклон, более близкий к -3,6, — более низкую.

Как рассчитать эффективность qPCR: метод калибровочной прямой

1. Подготовьте серию разведений. Начните с наиболее концентрированного образца и последовательно разводите каждый следующий образец в фиксированное число раз, обычно в 10. Проведите qPCR для каждого разведения и запишите его значение Ct.
2. Преобразуйте каждое разведение в значение log10. Если считать первый, наиболее концентрированный образец позицией 0, то для образца с номером i значение log10(относительного количества) равно -i × log10(коэффициента разведения).
3. Для каждого разведения постройте график зависимости Ct (вертикальная ось) от значения log10 (горизонтальная ось) и выполните линейную регрессию.
4. Определите наклон, точку пересечения и R² регрессионной прямой.
5. Подставьте наклон в формулу E = 10^(-1/наклон) - 1, чтобы получить эффективность.

Критерии качества калибровочной прямой

• R² не менее 0,98. Этот показатель отражает, насколько близко точки расположены к прямой. Более низкое значение часто указывает на ошибки пипетирования или непостоянную эффективность амплификации.
• Наклон от -3,1 до -3,6. Этому диапазону соответствует эффективность 90–110%.
• Не менее трёх точек разведения. Пять или шесть точек дают более надёжную прямую и облегчают выявление выбросов.
• Для наиболее концентрированного образца значение Ct должно быть около 15-20. Для наиболее разбавленного образца Ct должно оставаться ниже 35, поскольку более высокие значения приближаются к пределу обнаружения.

Пример расчёта

Серия из пяти разведений с кратностью 10 даёт следующие значения Ct — от наиболее концентрированного к наиболее разбавленному образцу: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Значения log10(относительного количества) равны 0, -1, -2, -3, -4, поскольку каждый шаг разведения добавляет -log10(10), то есть -1. Ct увеличивается на 3,5 цикла на каждом шаге, поэтому точки лежат на прямой, а линейная регрессия даёт:

• Наклон: -3,5
• Точка пересечения: 15,0
• R²: 1,0

Эффективность: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, то есть около 93 %.

Эффективность 93 % при R² = 1,0 соответствует стандартным критериям качества и подходит для количественного определения экспрессии генов.

Пример кода

Эта функция JavaScript использует тот же метод, что и калькулятор. Перед вычислением логарифма индекс каждого значения Ct берётся с противоположным знаком, поскольку первый, наиболее концентрированный образец имеет наибольшее относительное количество, а каждый следующий образец более разбавлен.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Почему эффективность важна для экспрессии генов

Расчёт кратности изменения, включая метод ΔΔCt, предполагает, что каждая реакция удваивает количество целевого продукта в каждом цикле. Если целевой и референсный гены имеют разную измеренную эффективность, обычная формула ΔΔCt вносит погрешность. При различии эффективности более чем примерно на пять процентных пунктов исследователи часто переходят к расчёту с поправкой на эффективность, например к методу, описанному Майклом Пфаффлом в 2001 году. Руководство MIQE — широко цитируемый набор стандартов представления результатов qPCR, опубликованный в 2009 году, — рекомендует указывать рассчитанные эффективность, наклон и R² вместе с результатами количественного определения.

Часто задаваемые вопросы

Какая эффективность qPCR в процентах считается хорошей?

Обычно приемлемым считается диапазон от 90 % до 110 %, а для хорошо оптимизированных тест-систем значения находятся около 95–105%. Наклону -3,32 соответствует эффективность ровно 100 %.

Почему эффективность моей qPCR выше 110 %?

К распространённым причинам относятся ошибки пипетирования при приготовлении серии разведений, праймер-димеры, ингибиторы, неодинаково влияющие на концентрированные и разбавленные образцы, или порог флуоресценции, заданный за пределами экспоненциальной фазы амплификации. Более одного пика на кривой плавления может указывать на праймер-димеры.

Почему эффективность моей qPCR ниже 90 %?

Вероятные причины включают неудачный дизайн праймеров, ингибиторы ПЦР, перенесённые из экстракта образца, или неоптимальную температуру отжига. Проверка специфичности праймеров и проведение температурного градиента могут помочь выявить причину.

Что означает низкое значение R²?

R² показывает, насколько хорошо значения Ct соответствуют прямой зависимости от логарифма количества. Значение ниже 0,98 указывает на непостоянство пипетирования, ингибированный образец или точку разведения, близкую к пределу обнаружения.

Сколько точек разведения нужно для калибровочной прямой?

Не менее трёх — это минимум, необходимый для линейной регрессии. Пять или шесть точек дают более надёжный наклон и облегчают выявление выбросов.

Может ли эффективность изменяться между экспериментами?

Да. Новая партия реагентов, новая партия праймеров, другой тип образца или другой прибор для qPCR могут изменить эффективность. Многие лаборатории повторно проверяют эффективность каждые несколько месяцев или при получении каждой новой партии реагентов.

Источники

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA и др. Руководство MIQE: минимальная информация для публикации экспериментов по количественной ПЦР в реальном времени. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Новая математическая модель относительного количественного определения в RT-ПЦР в реальном времени. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Насколько точна оценка эффективности ПЦР: рекомендации по точной и надёжной оценке эффективности qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.