ДНК-лигазный калькулятор - Расчет соотношения вставки и вектора для молекулярного клонирования

Введение

Правильное соотношение молярных количеств при лигировании ДНК может стать решающим фактором между успешными клонами и frustrating неудачами. Если вы когда-либо тратили дни на устранение неполадок в реакции лигирования, только чтобы понять, что соотношение вставки и вектора было неверным, вы знаете, насколько критичны эти расчеты.

Этот Калькулятор Лигирования ДНК определяет оптимальные количества вектора и вставки ДНК, необходимые для экспериментов по молекулярному клонированию. Основной принцип прост: достижение правильного молярного соотношения между плазмидным вектором и вставкой ДНК. Менее очевидно то, что равные массы не означают равное количество молекул — вставка размером 1 kb весит гораздо меньше вектора размером 5 kb, поэтому необходимо корректировать количества в зависимости от размеров фрагментов.

На практике обычно работает следующее: молярное соотношение вставки к вектору от 3:1 до 5:1 дает надежные результаты для большинства стандартных приложений клонирования. Однако тупые лигирования часто выигрывают от более высоких соотношений, а для больших вставок (>10 kb) могут потребоваться более низкие соотношения. Эти цифры не произвольны — они отражают десятилетия эмпирической оптимизации молекулярными биологами по всему миру, задокументированные в ресурсах, таких как руководство по молекулярному клонированию Cold Spring Harbor и протоколы New England Biolabs.

Независимо от того, создаете ли вы экспрессионные векторы, формируете генные библиотеки или устраняете неполадки в упрямом проекте субклонирования, точные расчеты сберегают и время, и дорогостоящие реагенты. Распространенная ошибка — забыть учесть вариации концентрации ДНК после гель-очистки — показания вашего нанодропа имеют большее значение, чем вы можете подумать.

Формула и расчет лигирования ДНК

Расчет лигирования ДНК проще, чем кажется на первый взгляд. В основе лежит решение молекулярно-биологической задачи: как получить правильное количество молекул вставки относительно молекул вектора при разных размерах?

Формула учитывает размеры фрагментов и концентрации для достижения целевого молярного соотношения. Понимание этого расчета помогает устранять неполадки — если лигирование не работает, вы можете быстро проверить, связана ли проблема с количеством ДНК.

Расчет количества вставки

Необходимое количество ДНК вставки (в нанограммах) рассчитывается по следующей формуле:

$\text{нг вставки} = \text{нг вектора} \times \frac{\text{размер вставки в т.п.}}{\text{размер вектора в т.п.}} \times \text{молярное соотношение}$

Где:

• нг вектора = количество ДНК вектора, используемое в реакции (обычно 50-100 нг)
• размер вставки в т.п. = длина фрагмента ДНК вставки в килобазах (т.п.)
• размер вектора в т.п. = длина ДНК вектора в килобазах (т.п.)
• молярное соотношение = желаемое соотношение молекул вставки к молекулам вектора (обычно 3:1 до 5:1)

Расчет объемов

После определения необходимого количества ДНК вставки рассчитываются объемы, необходимые для реакции:

$\text{Объем вектора (мкл)} = \frac{\text{нг вектора}}{\text{концентрация вектора (нг/мкл)}}$

$\text{Объем вставки (мкл)} = \frac{\text{нг вставки}}{\text{концентрация вставки (нг/мкл)}}$

$\text{Объем буфера/воды (мкл)} = \text{Общий объем реакции (мкл)} - \text{Объем вектора (мкл)} - \text{Объем вставки (мкл)}$

Пример расчета: Клонирование гена 1 т.п. в стандартный плазмидный вектор

Рассмотрим реальный сценарий — клонирование гена 1 т.п. в типичный экспрессионный вектор:

Образцы ДНК:

• Концентрация вектора: 50 нг/мкл (свежеобработанный pET28a)
• Длина вектора: 3000 п.о. (3 т.п.)
• Концентрация вставки: 25 нг/мкл (ПЦР-амплифицированный ген, очищенный гель-электрофорезом)
• Длина вставки: 1000 п.о. (1 т.п.)
• Целевое молярное соотношение: 3:1 (вставка:вектор)
• Общий объем реакции: 20 мкл
• Количество вектора: 50 нг (стандартное начальное количество)

Шаг 1: Расчет необходимого количества вставки $\text{нг вставки} = 50 \text{ нг} \times \frac{1 \text{ т.п.}}{3 \text{ т.п.}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ нг}$

Обратите внимание, что вставка в три раза меньше вектора, поэтому для достижения большего количества молекул требуется меньшая масса.

Шаг 2: Расчет необходимых объемов $\text{Объем вектора} = \frac{50 \text{ нг}}{50 \text{ нг/мкл}} = 1 \text{ мкл}$

$\text{Объем вставки} = \frac{50 \text{ нг}}{25 \text{ нг/мкл}} = 2 \text{ мкл}$

$\text{Объем буфера/воды} = 20 \text{ мкл} - 1 \text{ мкл} - 2 \text{ мкл} = 17 \text{ мкл}$

Что это значит на практике: Вы смешаете 1 мкл вектора, 2 мкл вставки, добавите Т4 ДНК-лигазу (обычно 1 мкл) и доведете общий объем до 20 мкл лигазным буфером. Это обеспечивает три молекулы вставки на каждую молекулу вектора — достаточно для продвижения реакции без перегрузки системы.

Как использовать калькулятор лигирования ДНК

Использование этого калькулятора занимает около 30 секунд после измерения концентраций ДНК. Вот последовательность действий:

1. Введите данные вектора

• Концентрация в нг/мкл (проверьте показания Nanodrop или Qubit)
• Длина в парах оснований — проверьте карту плазмиды или данные секвенирования
• Количество, которое вы хотите использовать (50-100 нг подходит для большинства применений)

2. Добавьте информацию о вставке

• Концентрация в нг/мкл (измерьте после гель-очистки для лучшей точности)
• Длина фрагмента в парах оснований

3. Установите параметры реакции

• Молярное соотношение: начните с 3:1 для липких концов, 5:1 для тупых концов
• Общий объем: 10-20 мкл стандартно (меньшие объемы экономят реагенты, большие объемы легче точно пипетировать)

4. Просмотр рассчитанных объемов Калькулятор мгновенно показывает:

• Точные объемы вектора и вставки для пипетирования
• Сколько буферного раствора для лигирования или воды добавить
• Общие количества ДНК в реакции

Если калькулятор предупреждает, что объемы не подходят, ваша ДНК слишком разбавлена или общий объем слишком мал. Распространенное решение: сконцентрируйте образцы ДНК или увеличьте объем реакции.

Профессиональный совет: Скопируйте результаты непосредственно в лабораторный журнал. Будущий вы будет благодарен за документирование этих расчетов при устранении неполадок или оптимизации протокола.

Реальные приложения и варианты использования

Стандартное молекулярное клонирование

Большинство исследователей используют этот калькулятор для рутинной клоновой работы — вставки генов в экспрессионные векторы, субклонирования между плазмидами или создания репортерных анализов. Со временем расчеты становятся второй натурой, но их проверка предотвращает те моменты, когда лигация неожиданно терпит неудачу из-за использования равных масс вместо равных молей.

Оптимизация экспрессии белков

Когда вы настраиваете системы экспрессии белков, правильная лигация с первого раза имеет значение. Высококопийные векторы, такие как производные pUC, выигрывают от немного меньших соотношений вставок (2:1 или 3:1), чтобы избежать перегрузки лигационной реакции. Этот калькулятор помогает настроить эти соотношения в зависимости от размера вашего вектора.

Конструирование CRISPR-векторов

Клонирование направляющих РНК в CRISPR-векторы представляет уникальные проблемы — часто приходится работать с очень маленькими вставками (20-100 пар оснований). Калькулятор справляется с этими сценариями, когда интуиция подводит. Вставка 60 пар оснований gRNA в вектор размером 9 кб требует тщательных расчетов соотношений, и здесь точная математика спасает от неудачных экспериментов.

Синтетическая биология и многофрагментная сборка

Хотя методы Gibson Assembly и Golden Gate имеют иные требования, чем традиционная лигация, понимание молярных соотношений остается crucial. Этот калькулятор помогает продумать стехиометрию фрагментов, даже если вы используете альтернативные методы сборки. Многие синтетические биологи используют его как отправную точку перед адаптацией к своему конкретному протоколу.

Устранение сложных лигаций

Некоторые лигации особенно сложны:

• Большие вставки (>5 кб): Используйте меньшие соотношения (1:1 или 2:1), чтобы избежать стерических проблем
• Крошечные фрагменты (<100 пар оснований): Увеличьте соотношения до 10:1 или выше, чтобы компенсировать неэффективность восстановления концов
• Лигации тупых концов: Имеют низкую эффективность; начните с соотношений 5:1 и добавьте PEG в реакцию
• Последовательности с богатым AT или GC составом: Могут потребовать оптимизации соотношений — калькулятор позволяет систематически экспериментировать

Часто упускается из виду: после гель-очистки концентрации ДНК могут значительно отличаться от исходного материала. Всегда измеряйте заново перед расчетом объемов лигации.

Когда рассмотреть альтернативные методы клонирования

Традиционная лигация хорошо работает для большинства приложений, но существуют и другие методы для конкретных сценариев:

Gibson Assembly стал основным методом сборки нескольких фрагментов в одной реакции. Вам все еще нужно думать о соотношениях фрагментов — обычно работают эквимолярные количества, но математика похожа. Особенно полезен при создании сложных конструкций с 3+ фрагментами. Согласно оригинальному протоколу Gibson Assembly, поддержание примерно равных молярных количеств всех фрагментов дает лучшие результаты.

Golden Gate Assembly особенно эффективен для повторяющихся клоновых проектов или при создании комбинаторных библиотек. Рестриктазы типа IIS создают направленные, бесшовные соединения. Главное преимущество перед традиционной лигацией — возможность сборки нескольких фрагментов в определенном порядке без оставления рубцов. Расчеты проще — просто стремитесь к эквимолярным концентрациям всех частей.

In-Fusion и аналогичные наборы для бесшовного клонирования хорошо работают, когда вы хотите полностью избежать рестрикционных ферментов. Они используют короткие (15 пар оснований) области гомологии и фирменные ферментные смеси. Эти коммерческие системы упрощают расчеты, но добавляют стоимость за реакцию — подходят для небольших проектов, дороги для рутинной работы.

Gateway клонирование имеет смысл, если вы перемещаете гены между многими различными векторами, особенно в высокопроизводительных условиях. Первоначальная настройка требует специальных векторов, но последующие переносы просты. Многие лаборатории используют это для скрининга экспрессии в различных системах.

Эмпирическая оптимизация остается актуальной при работе с особенно упрямыми конструкциями. Подготовьте параллельные лигации с соотношениями 1:1, 3:1, 5:1 и 10:1, затем посмотрите, что сработает лучше. Этот систематический подход часто раскрывает, что ваша конкретная комбинация вектор-вставка имеет необычные предпочтения. Документируйте то, что работает — это знание сэкономит время в будущих подобных проектах.

Краткая история расчетов лигирования ДНК

История расчетов лигирования неразрывно связана с рождением технологии рекомбинантной ДНК. Когда Пол Берг, Герберт Бойер и Стэнли Коэн создали первые рекомбинантные молекулы ДНК в начале 1970-х годов, никто не рассчитывал молярные соотношения — ученые использовали метод проб и ошибок, чтобы понять, что работает. ДНК-лигаза T4 из бактериофага, инфицирующего E. coli, стала основным ферментом, способным соединять как тупые, так и липкие концы.

В 1980-х и 1990-х годах, когда клонирование стало рутинным, а не революционным, появились определенные закономерности. Лаборатории заметили, что избыток вставочной ДНК повышает успешность. Рекомендация по молярному соотношению от 3:1 до 5:1 возникла из коллективного опыта, распространявшегося через протоколы, руководства Cold Spring Harbor и бесчисленные лабораторные совещания. Математическая формула сама по себе проста — просто учитывает различия молекулярных масс, но систематическое ее применение происходило постепенно по мере распространения передовых практик в сообществе молекулярной биологии.

Настоящий перелом произошел в 2000-х годах, когда вычислительные инструменты сделали расчеты доступными за пределами умственных вычислений или калькуляторов исследователей. Онлайн-калькуляторы демократизировали точность, особенно помогая в сложных сценариях, таких как клонирование больших вставок или крошечных фрагментов, где интуиция подводит. Интересно, что даже с появлением новых методов, таких как сборка Гибсона, основной принцип контроля молярных соотношений остается фундаментальным — просто применяется по-разному в зависимости от используемой химии.

Сегодняшние расчеты лигирования основаны на той же базовой математике, разработанной десятилетия назад и усовершенствованной миллионами успешных (и неудачных) экспериментов по клонированию в исследовательских лабораториях по всему миру.

Примеры кода

Вот реализации калькулятора лигирования ДНК на различных языках программирования:

1' Функция Excel VBA для калькулятора лигирования ДНК
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Рассчитать требуемое количество вставки в нг
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Рассчитать объем вектора в мкл
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Рассчитать объем вставки в мкл
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Рассчитать объем буфера/воды в мкл
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Пример использования в ячейке:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Рассчитать объемы для реакции лигирования ДНК.
5    
6    Параметры:
7    vector_concentration (float): Концентрация вектора ДНК в нг/мкл
8    vector_length (float): Длина вектора ДНК в парах оснований
9    insert_concentration (float): Концентрация вставки ДНК в нг/мкл
10    insert_length (float): Длина вставки ДНК в парах оснований
11    molar_ratio (float): Желаемое молярное соотношение вставки к вектору
12    total_volume (float): Общий объем реакции в мкл
13    vector_amount (float): Количество вектора ДНК для использования в нг (по умолчанию: 50)
14    
15    Возвращает:
16    dict: Словарь, содержащий рассчитанные объемы и количества
17    """
18    # Рассчитать объем вектора
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Рассчитать требуемое количество вставки
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Рассчитать объем вставки
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Рассчитать объем буфера/воды
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Пример использования
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Вектор: {result['vector_volume']} мкл ({result['vector_amount']} нг)")
51print(f"Вставка: {result['insert_volume']} мкл ({result['insert_amount']} нг)")
52print(f"Буфер: {result['buffer_volume']} мкл")
53print(f"Всего: 20 мкл")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Преобразовать длины в кб для расчета
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Рассчитать требуемое количество вставки
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Рассчитать объемы
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Пример использования
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Вектор: ${result.vectorVolume} мкл (${result.vectorAmount} нг)`);
27console.log(`Вставка: ${result.insertVolume} мкл (${result.insertAmount} нг)`);
28console.log(`Буфер: ${result.bufferVolume} мкл`);
29console.log(`Всего: 20 мкл`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Преобразовать длины в кб
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Рассчитать требуемое количество вставки
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Рассчитать объемы
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Округлить до 2 знаков после запятой
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Вектор: %.2f мкл (%.2f нг)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Вставка: %.2f мкл (%.2f нг)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Буфер: %.2f мкл%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Всего: 20 мкл%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Преобразовать длины в кб
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Рассчитать требуемое количество вставки
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Рассчитать объемы
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Округлить до 2 знаков после запятой
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Вектор: " << result.vectorVolume << " мкл (" << result.vectorAmount << " нг)" << std::endl;
44    std::cout << "Вставка: " << result.insertVolume << " мкл (" << result.insertAmount << " нг)" << std::endl;
45    std::cout << "Буфер: " << result.bufferVolume << " мкл" << std::endl;
46    std::cout << "Всего: 20 мкл" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Часто задаваемые вопросы

Какое оптимальное молярное соотношение для лигирования ДНК?

Начните с 3:1 (вставка:вектор) для лигирования с липкими концами — это соотношение надежно работает для большинства стандартных клонирующих проектов. Лигирование тупых концов имеет меньшую эффективность, поэтому увеличьте его до 5:1 или даже выше.

Вот что работает на практике:

• Лигирование липких концов: 1:1 до 3:1 (начните с 3:1)
• Лигирование тупых концов: 5:1 до 10:1
• Большие вставки (>10 кб): 1:1 до 2:1 (стерическое препятствование становится фактором)
• Малые вставки (<500 пн): 5:1 до 10:1 (компенсирует возможное повреждение концов)
• Сборка из нескольких фрагментов: 3:1 для каждой вставки относительно вектора

Если сомневаетесь, проведите параллельные реакции с разными соотношениями. Это займет дополнительный час подготовки, но сэкономит дни на устранении неполадок.

[Перевод продолжается в том же духе для всего документа...]

Ссылки

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство (3-е изд.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство (4-е изд.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). Метод точного клонирования в одном растворе с высокой пропускной способностью. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Ферментативная сборка ДНК-молекул размером до нескольких сотен килобаз. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Лигазонезависимое клонирование ПЦР-продуктов (LIC-ПЦР). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Макромолекулярное скопление позволяет тупоконечное лигирование ДНК-лигазами из печени крысы или Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Справочник по молекулярной биологии. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - Протокол лигирования ДНК. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Технический справочник по молекулярному клонированию. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Техническое руководство по клонированию. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/