ДНК-лигазный калькулятор - Расчет соотношения вставки и вектора для молекулярного клонирования

Лигирование ДНК — это этап молекулярного клонирования, на котором фрагмент-вставка соединяют с плазмидным вектором с помощью фермента T4 ДНК-лигазы. Калькулятор лигирования ДНК рассчитывает, сколько микролитров ДНК-вставки и ДНК-вектора нужно смешать, чтобы в реакции достигалось выбранное молярное соотношение вставки и вектора.

Что делает калькулятор

Калькулятор использует шесть входных параметров: концентрацию вектора, длину вектора, концентрацию вставки, длину вставки, целевое молярное соотношение вставки и вектора и общий объём реакции. Также можно задать количество используемой ДНК-вектора; по умолчанию оно составляет 50 нанограмм (нг). На основе этих значений калькулятор рассчитывает объём вектора и объём вставки для пипетирования, а также количество буфера или воды, необходимое для достижения общего объёма реакции.

Концентрацию измеряют в нанограммах на микролитр (нг/мкл), обычно с помощью прибора NanoDrop или Qubit. Длину измеряют в парах оснований (п.н.). Одна килобаза соответствует 1000 парам оснований. Молярное соотношение показывает, сколько молекул вставки должно приходиться на одну молекулу вектора. Это не массовое соотношение.

Почему используют молярное соотношение, а не массу

Равные массы ДНК не содержат равного числа молекул. Короткая вставка весит меньше, чем длинный вектор при одинаковом числе молекул. Если смешать равные количества короткой вставки и длинного вектора в нанограммах, молекул вставки окажется слишком мало по сравнению с молекулами вектора. Калькулятор масштабирует массу вставки с учётом соотношения длин фрагментов, чтобы в конечной смеси на одну молекулу вектора приходилось предусмотренное число молекул вставки.

Формула лигирования ДНК

Необходимое количество ДНК-вставки в нанограммах рассчитывают так:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

где $m_i$ — количество вставки в нанограммах, $m_v$ — количество вектора в нанограммах, $k_i$ — длина вставки в килобазах, $k_v$ — длина вектора в килобазах, а R — целевое мольное соотношение вставки и вектора.

После определения этого количества калькулятор переводит количество каждого компонента в объём, который можно отмерить пипеткой:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

где $V_v$ и $V_i$ — объёмы вектора и вставки в микролитрах, $c_v$ и $c_i$ — концентрации вектора и вставки в нанограммах на микролитр, $V_b$ — объём буфера, а $V_t$ — общий объём реакции.

Если суммарный объём вектора и вставки превышает общий объём реакции, места для буфера, лигазы или воды не остаётся. В таком случае калькулятор сообщает, что общий объём слишком мал, вместо того чтобы показывать отрицательный объём буфера.

Разобранный пример

Исследователь клонирует фрагмент гена длиной 1 кб в плазмидный вектор длиной 3 кб. Планируется использовать 50 нг ДНК-вектора при молярном соотношении вставки и вектора 3:1 в реакции объёмом 20 мкл.

Исходные данные:

• Концентрация вектора: 50 нг/мкл
• Длина вектора: 3000 п.н. (3 кб)
• Концентрация вставки: 25 нг/мкл
• Длина вставки: 1000 п.н. (1 кб)
• Молярное соотношение: 3
• Общий объём: 20 мкл
• Количество вектора: 50 нг

Шаг 1: количество вставки

нг вставки = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 нг

Шаг 2: объёмы

Объём вектора = 50 нг ÷ 50 нг/мкл = 1 мкл

Объём вставки = 50 нг ÷ 25 нг/мкл = 2 мкл

Объём буфера = 20 − 1 − 2 = 17 мкл

Реакция состоит из 1 мкл вектора, 2 мкл вставки и 17 мкл буфера или воды; сюда же добавляют лигазу и её реакционный буфер. В этой смеси на одну молекулу вектора приходится три молекулы вставки.

Типичные молярные соотношения при лигировании

При большинстве стандартных процедур клонирования с липкими, выступающими концами используют соотношение вставки и вектора 3:1. Лигирование фрагментов с тупыми концами менее эффективно, поэтому часто используют более высокое соотношение, например 5:1. Для очень крупных вставок иногда лучше подходит более низкое соотношение, близкое к 1:1, поскольку крупные фрагменты уже содержат много пар оснований на молекулу.

Часто задаваемые вопросы

Что такое лигирование ДНК?

Лигирование ДНК — это соединение двух фрагментов ДНК, обычно плазмидного вектора и вставки, в одну непрерывную молекулу. Фермент T4 ДНК-лигаза сшивает концы фрагментов.

Что означает молярное соотношение вставки и вектора?

Это число молекул ДНК-вставки, приходящихся на одну молекулу вектора в реакции. Соотношение 3:1 означает три молекулы вставки на каждую молекулу вектора, независимо от соотношения их масс.

Почему нельзя использовать равные количества вектора и вставки в нанограммах?

Фрагменты ДНК разной длины имеют разную массу на молекулу. Вставка длиной 1 кб весит примерно в три раза меньше, чем вектор длиной 3 кб, если сравнивать отдельные молекулы. Равные количества каждого фрагмента в нанограммах не дадут равного числа молекул, поэтому калькулятор корректирует массу вставки в соответствии с целевым молярным соотношением.

Что означает слишком малый общий объём?

Это означает, что объёмы вектора и вставки уже полностью занимают объём реакции, и места для буфера или лигазы не остаётся. Решение состоит в увеличении общего объёма реакции или использовании более концентрированных исходных растворов ДНК.

Можно ли использовать этот калькулятор для клонирования методом Gibson Assembly или Golden Gate?

Нет. В этих методах используется другая химия реакции, и обычно стремятся получить эквимолярные количества всех фрагментов, а не фиксированное соотношение вставки и вектора. Расчёты объёмов для них отличаются от расчётов для стандартного клонирования с T4-лигазой.

Сколько ДНК-вектора обычно используют?

50 нг — распространённое исходное количество для стандартной реакции лигирования. В лабораториях также используют от 25 до 100 нг, корректируя количество с учётом концентрации ДНК и масштаба реакции.