Kalkulačka riedenia buniek

Kalkulačka riedenia buniek určuje, koľko bunkovej suspenzie a koľko riedidla treba zmiešať, aby sa v zvolenom konečnom objeme dosiahla požadovaná koncentrácia buniek. Používa sa v bunkových kultúrach, mikrobiológii a pri ďalšej laboratórnej práci, keď treba vzorku pred použitím upraviť na presnú koncentráciu.

Čo znamená riedenie buniek

Riedením bunkovej suspenzie sa nemení počet buniek, ktoré obsahuje. Mení sa iba objem kvapaliny, v ktorej sa bunky nachádzajú, čím sa znižuje ich koncentrácia. Suspenzia s koncentráciou 1 000 000 buniek na mililiter (buniek/ml) obsahuje po zriedení stále rovnaký celkový počet buniek. Tento počet je jednoducho rozptýlený vo väčšom objeme kvapaliny.

V laboratóriách sa bunky riedia pred mnohými bežnými postupmi: pri rozdelení rastúcej kultúry do nových baniek, pri nasadení pevného počtu buniek do každej jamky platničky, pri zmrazovaní buniek na uskladnenie alebo pri príprave vzorky pre počítač buniek či prietokový cytometer.

Vzorec na riedenie buniek

Výpočet vychádza z jedného pravidla. Počet buniek odobratých zo zásobnej suspenzie vynásobený jej koncentráciou sa musí rovnať počtu buniek v konečnom objeme vynásobenému požadovanou koncentráciou:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — počiatočná (zásobná) koncentrácia v bunkách/ml
V₁ — objem zásobnej suspenzie, ktorý sa má použiť, v ml
C₂ — požadovaná koncentrácia v bunkách/ml
V₂ — potrebný celkový konečný objem v ml

Po úprave vzorca na V₁ získame objem zásobnej suspenzie, ktorý treba odpipetovať:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Zvyšok konečného objemu tvorí riedidlo, zvyčajne médium pre bunkové kultúry, fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) alebo iný pufor:

Objem riedidla = V₂ − V₁

Požadovaná koncentrácia (C₂) nikdy nemôže byť vyššia ako zásobná koncentrácia (C₁). Riedenie koncentráciu iba znižuje. Jej zvýšenie si vyžaduje centrifugáciu buniek a ich resuspendovanie v menšom objeme kvapaliny.

Ako vypočítať riedenie buniek

Spočítajte bunky v zásobnej suspenzii pomocou hemocytometra alebo automatického počítača buniek a získajte C₁.
Poznačte si požadovanú koncentráciu C₂ podľa protokolu.
Určte potrebný celkový konečný objem V₂.
Vypočítajte V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Vypočítajte objem riedidla ako V₂ − V₁.
Odpipetujte V₁ zásobnej suspenzie do skúmavky a potom pridajte príslušný objem média alebo pufra ako riedidla.

Vyriešený príklad

Zásobná suspenzia má koncentráciu 1 000 000 buniek/ml. Protokol vyžaduje 100 000 buniek/ml v konečnom objeme 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Objem riedidla = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Odobratím 1 mL zásobnej suspenzie a pridaním 9 mL média získame 10 mL suspenzie s koncentráciou 100 000 buniek/ml.

Druhý príklad

Test v platničke s 96 jamkami vyžaduje 10 000 buniek v každej jamke v 200 mikrolitroch (μL) média na jamku. Ide o požadovanú koncentráciu 50 000 buniek/ml, pretože 10 000 buniek delených objemom 0,2 mL sa rovná 50 000 bunkám/ml. Zásobná suspenzia má koncentráciu 2 000 000 buniek/ml a na pokrytie platničky s určitou rezervou pre straty pri pipetovaní je potrebných celkovo 20 mL.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Objem riedidla = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Zmiešaním 0,5 mL zásobnej suspenzie s 19,5 mL média získame 20 mL suspenzie s koncentráciou 50 000 buniek/ml, čo predstavuje riedenie 1 ku 40.

Zdroje chýb

Samotný vzorec je presný. Chyby vznikajú v dôsledku čísel dosadených do vzorca.

Chyba pri počítaní. Nesprávne spočítaný počet buniek vedie priamo k nesprávnemu riedeniu. Toto riziko znižuje spočítanie všetkých štyroch rohových štvorcov mriežky hemocytometra a ich spriemerovanie.
Zhluky buniek. Zhluk buniek vyzerá pod mikroskopom ako jedna bunka, v skutočnosti ich však obsahuje niekoľko, takže znižuje zdanlivú koncentráciu.
Rozsah pipety. Pipeta používaná mimo svojho určeného objemového rozsahu poskytuje nepresné výsledky. Pipeta s objemom 1000 μL nastavená na dávkovanie 5 μL nie je spoľahlivá; namiesto nej treba použiť menšiu pipetu.
Zámena jednotiek. Zmiešanie jednotiek bunky/ml a bunky/μl spôsobí chybu tisíckrát väčšiu alebo menšiu, než má byť.
Mŕtve bunky. Pri bežnom počítaní buniek sa započítajú aj mŕtve bunky, ak sa nepoužilo farbenie životaschopnosti, napríklad trypánová modrá. Výsledkom môže byť nadhodnotený počet skutočne prítomných živých buniek.

Obmedzenia tejto kalkulačky

Kalkulačka odmietne čísla, z ktorých nemožno získať užitočný výsledok:

Každá hodnota musí byť väčšia ako nula.
Požadovaná koncentrácia nemôže byť vyššia ako počiatočná koncentrácia.
Počiatočná koncentrácia musí byť najviac 1 bilión buniek/ml (1 × 10¹²).
Vypočítaný objem zásobnej suspenzie musí byť najmenej 0,001 mL, čo je 1 mikroliter. Menší objem nemožno presne odpipetovať, preto kalkulačka vyžiada iné hodnoty. Tento problém zvyčajne vyrieši zvýšenie celkového objemu.

Objemy sa zobrazujú na dve desatinné miesta, alebo na tri, ak je objem zásobnej suspenzie menší ako 0,01 mL, aby sa malý objem nikdy nezobrazil ako 0,00 mL.

Najčastejšie otázky

Aký je vzorec na riedenie buniek?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, pričom C₁ a C₂ sú počiatočná a požadovaná koncentrácia a V₁ a V₂ sú objem odobratý zo zásobnej suspenzie a celkový konečný objem.

Môže byť požadovaná koncentrácia vyššia ako počiatočná koncentrácia?

Nie. Riedenie koncentráciu iba znižuje. Dosiahnutie vyššej koncentrácie si vyžaduje centrifugáciu buniek a ich resuspendovanie v menšom objeme.

Aká kvapalina sa má použiť na riedenie buniek?

Kompletné kultivačné médium sa používa, keď bunky musia zostať životaschopné niekoľko hodín alebo dní, napríklad pred nasadením do platničky. PBS alebo podobný pufrovaný fyziologický roztok je vhodný na krátkodobé riedenie, kratšie než približne 30 minút, pred ďalším spracovaním buniek. Médium bez séra sa používa vtedy, keď by sérové bielkoviny interferovali s následným testom.

Funguje tento vzorec aj pre baktérie alebo kvasinky?

Áno. Vzťah C₁V₁ = C₂V₂ platí pre akúkoľvek suspenziu častíc vrátane baktérií meraných v jednotkách tvoriacich kolónie na mililiter (CFU/ml), kvasiniek a vírusových častíc meraných v jednotkách tvoriacich plaky na mililiter (PFU/ml), pokiaľ sa na oboch stranách rovnice používajú rovnaké jednotky.

Majú sa pri riedení započítavať mŕtve bunky?

Pri nasádzaní živej kultúry sa majú započítavať iba životaschopné bunky. Ak je suspenzia životaschopná na 80 %, jej životaschopná koncentrácia je 0,8-násobkom celkového počtu buniek a táto životaschopná koncentrácia sa má použiť ako C₁.

Ako možno presne pripraviť veľmi veľké riedenia?

Veľké riedenia, napríklad 1 ku 1000, sa zvyčajne pripravujú sériou menších krokov nazývaných sériové riedenia. Tri po sebe nasledujúce riedenia 1 ku 10 dosiahnu celkové riedenie 1 ku 1000, pričom každý krok pipetovania zostane v presnom objemovom rozsahu.

Kalkulačka riedenia buniek - presný laboratórny nástroj na riedenie