Vypočítajte efektivitu PCR z hodnôt Ct a faktorov riedenia. Analyzujte štandardné krivky, určte efektivitu amplifikácie a overte svoje kvantitatívne PCR experimenty.
Hodnota musí byť kladná
Hodnota musí byť kladná
Hodnota musí byť kladná
Hodnota musí byť kladná
Hodnota musí byť kladná
Zadajte platné údaje na generovanie grafu
Účinnosť qPCR je miera toho, ako dobre PCR reakcia funguje. Účinnosť 100 % znamená, že množstvo PCR produktu sa zdvojnásobí s každým cyklom počas exponenciálnej fázy.
Účinnosť sa vypočíta zo sklonu štandardnej krivky, ktorá sa získa vykreslením Ct hodnôt proti logaritmu počiatočnej koncentrácie šablóny (séria zriedení).
Účinnosť (E) sa vypočíta pomocou vzorca:
E = 10^(-1/slope) - 1
Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia (qPCR) efektivita je kritický parameter, ktorý priamo ovplyvňuje presnosť a spoľahlivosť vašich qPCR experimentov. qPCR efektivita kalkulátor pomáha výskumníkom určiť, ako efektívne ich PCR reakcie amplifikujú cieľové DNA sekvencie s každým cyklom teploty. Ideálne qPCR reakcie by mali mať efektivitu medzi 90-110%, čo naznačuje, že množstvo PCR produktu sa približne zdvojnásobí s každým cyklom počas exponenciálnej fázy.
Nedostatočná amplifikačná efektivita môže viesť k nepresnému kvantifikovaniu, nespoľahlivým výsledkom a chybným experimentálnym záverom. Vypočítaním a sledovaním vašej qPCR efektivity môžete optimalizovať podmienky reakcie, validovať návrhy primerov a zabezpečiť kvalitu vašich kvantitatívnych PCR údajov.
Tento kalkulátor používa metódu štandardnej krivky, ktorá zobrazuje hodnoty cyklického prahu (Ct) proti logaritmu koncentrácie vzorky (reprezentovanej sériovými zriedeniami), na určenie efektivity vašej qPCR analýzy. Výsledný sklon tejto štandardnej krivky sa potom používa na výpočet amplifikačnej efektivity pomocou jednoduchého matematického vzorca.
Efektivita qPCR reakcie sa vypočíta zo sklonu štandardnej krivky pomocou nasledujúceho vzorca:
Kde:
Pre ideálnu PCR reakciu s 100% efektivitou (dokonalé zdvojenie amplicónov s každým cyklom) by bol sklon -3,32. To je preto, lebo:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (alebo 100%)}
Percento efektivity sa vypočíta vynásobením desatinnej efektivity číslom 100:
\text{Efektivita (%)} = E \times 100\%
Štandardná krivka sa vytvára zobrazením Ct hodnôt (y-os) proti logaritmu počiatočnej koncentrácie vzorky alebo faktora zriedenia (x-os). Vzťah medzi týmito premennými by mal byť lineárny a kvalita tohto lineárneho vzťahu sa hodnotí pomocou koeficientu determinácie (R²).
Pre spoľahlivé výpočty qPCR efektivity:
Príprava údajov: Kalkulátor berie vaše Ct hodnoty pre každý zriedene bod a faktor zriedenia ako vstupy.
Logaritmická transformácia: Zriedene série sa transformujú do logaritmického rozsahu (logaritmus základ 10).
Lineárna regresia: Kalkulátor vykonáva analýzu lineárnej regresie na logom transformovaných údajoch, aby určil sklon, y-priesečník a R² hodnotu.
Výpočet efektivity: Pomocou hodnoty sklonu sa efektivita vypočíta pomocou vzorca E = 10^(-1/slope) - 1.
Interpretácia výsledkov: Kalkulátor zobrazí efektivitu ako percento, spolu so sklonom a R² hodnotou, aby vám pomohol posúdiť spoľahlivosť vašej qPCR analýzy.
Postupujte podľa týchto krokov na výpočet vašej qPCR efektivity:
Nastavte počet zriedení: Vyberte, koľko zriedených bodov máte vo svojej štandardnej krivke (odporúča sa medzi 3-7 bodmi).
Zadajte faktor zriedenia: Zadajte faktor zriedenia použitý medzi po sebe idúcimi vzorkami (napr. 10 pre 10-násobné zriedenie, 5 pre 5-násobné zriedenie).
Zadajte Ct hodnoty: Zadajte Ct hodnoty pre každý zriedený bod. Typicky prvé zriedenie (Zriedenie 1) obsahuje najvyššiu koncentráciu vzorky, čo vedie k najnižšej Ct hodnote.
Zobrazte výsledky: Kalkulátor automaticky vypočíta a zobrazí:
Interpretujte výsledky: Posúďte, či vaša qPCR efektivita spadá do akceptovateľného rozsahu (90-110%) a či R² hodnota naznačuje spoľahlivú štandardnú krivku (≥ 0.98).
Kopírujte výsledky: Použite tlačidlo "Kopírovať výsledky" na skopírovanie všetkých vypočítaných hodnôt pre vaše záznamy alebo publikácie.
Poďme si prejsť príklad:
Keď sú zobrazené na štandardnej krivke:
Kalkulátor vykoná lineárnu regresiu a určí:
Použitím vzorca efektivity:
To naznačuje dobrú qPCR efektivitu 93%, ktorá spadá do akceptovateľného rozsahu 90-110%.
Pred použitím nového páru primerov pre kvantitatívne experimenty je nevyhnutné overiť jeho výkon. Vypočítanie qPCR efektivity pomáha:
Pri vývoji nových qPCR analýz sú výpočty efektivity kľúčové pre:
V experimentoch relatívneho kvantifikovania je znalosť PCR efektivity nevyhnutná pre:
V klinických a diagnostických nastaveniach je qPCR efektivita dôležitá pre:
Pre environmentálne a bezpečnostné aplikácie potravín pomáhajú výpočty efektivity:
Aj keď je metóda štandardnej krivky najbežnejším prístupom na výpočet qPCR efektivity, existujú alternatívne metódy:
Táto metóda vypočítava efektivitu z fluorescenčných údajov jedinej amplifikačnej krivky, bez potreby zriedenej série. Softvér ako LinRegPCR analyzuje exponenciálnu fázu jednotlivých reakcií na určenie efektivity.
Výhody:
Nevýhody:
Digitálna PCR (dPCR) poskytuje absolútne kvantifikovanie bez potreby štandardnej krivky alebo výpočtov efektivity.
Výhody:
Nevýhody:
Niektoré softvéry na analýzu qPCR ponúkajú porovnávacie kvantifikačné metódy, ktoré odhadujú efektivitu bez úplnej štandardnej krivky.
Výhody:
Nevýhody:
Vývoj qPCR a výpočty efektivity sa v priebehu posledných niekoľkých desaťročí výrazne vyvinuli:
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) bola vynájdená Karym Mullisom v roku 1983, čo revolucionalizovalo molekulárnu biológiu. Avšak tradičná PCR bola iba kvalitatívna alebo polokvantitatívna. Prvý systém real-time PCR bol vyvinutý na začiatku 90. rokov Russellom Higuchim a jeho kolegami, ktorí preukázali, že monitorovanie PCR produktov, ako sa akumulujú (použitím fluorescencie etídium bromidu), môže poskytnúť kvantitatívne informácie.
Ako sa technológia qPCR vyvíjala, výskumníci si uvedomili dôležitosť štandardizácie a validácie. Koncept efektivity PCR sa stal centrálnym pre spoľahlivé kvantifikovanie:
Oblasť sa naďalej vyvíjala s:
Dnes je vypočítanie a uvádzanie qPCR efektivity považované za nevyhnutné pre publikovanie spoľahlivých qPCR údajov a nástroje ako tento kalkulátor pomáhajú výskumníkom dodržiavať osvedčené postupy v tejto oblasti.
1' Excel vzorec na výpočet qPCR efektivity zo sklonu
2' Umiestnite do bunky B2, ak je sklon v bunke A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel vzorec na konverziu efektivity na percento
6' Umiestnite do bunky C2, ak je desatinná efektivita v bunke B2
7=B2*100
8
9' Funkcia na výpočet efektivity z Ct hodnôt a faktora zriedenia
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Vypočítajte lineárnu regresiu
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Vypočítajte sklon
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Vypočítajte efektivitu
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R funkcia na výpočet qPCR efektivity z Ct hodnôt a faktora zriedenia
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Vytvorte log zriedené hodnoty
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Vykonajte lineárnu regresiu
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extrahujte sklon a R-štvorcový
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Vypočítajte efektivitu
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Vráťte výsledky
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Príklad použitia
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektivita: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Sklon: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-štvorcový: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Vypočítajte qPCR efektivitu z Ct hodnôt a faktora zriedenia.
8
9 Parametre:
10 ct_values (list): Zoznam Ct hodnôt
11 dilution_factor (float): Faktor zriedenia medzi po sebe idúcimi vzorkami
12
13 Návrat:
14 dict: Slovník obsahujúci efektivitu, sklon, r_squared a intercept
15 """
16 # Vytvorte log zriedené hodnoty
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Vykonajte lineárnu regresiu
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Vypočítajte efektivitu
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Zobrazte štandardnú krivku s regresnou čiarou.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generujte body pre regresnú čiaru
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Zriedenie')
48 plt.ylabel('Ct Hodnota')
49 plt.title('qPCR Štandardná Krivka')
50
51 # Pridajte rovnicu a R² do grafu
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efektivita = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Príklad použitia
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektivita: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Sklon: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-štvorcový: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Zobrazte štandardnú krivku
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Vypočítajte qPCR efektivitu z Ct hodnôt a faktora zriedenia
3 * @param {Array<number>} ctValues - Pole Ct hodnôt
4 * @param {number} dilutionFactor - Faktor zriedenia medzi po sebe idúcimi vzorkami
5 * @returns {Object} Objekt obsahujúci efektivitu, sklon, rSquared a intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Vytvorte log zriedené hodnoty
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Vypočítajte priemery pre lineárnu regresiu
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Vypočítajte sklon a intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Vypočítajte R-štvorcový
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Vypočítajte efektivitu
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Príklad použitia
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektivita: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Sklon: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-štvorcový: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Dobrá qPCR efektivita typicky spadá medzi 90% a 110% (0.9-1.1). Efektivita 100% predstavuje dokonalé zdvojenie PCR produktu s každým cyklom. Efektivity mimo tohto rozsahu môžu naznačovať problémy s návrhom primerov, podmienkami reakcie alebo prítomnosťou inhibítorov.
Efektivity väčšie ako 100% môžu nastať z dôvodu:
Nízka R² hodnota (pod 0.98) naznačuje slabú linearitu vo vašej štandardnej krivke, čo môže byť spôsobené:
Pre spoľahlivé výpočty efektivity je potrebné minimálne 3 zriedené body, ale odporúča sa 5-6 bodov pre presnejšie výsledky. Tieto body by mali pokrývať celý dynamický rozsah očakávaných koncentrácií vzorky vo vašich experimentálnych vzorkách.
V relatívnom kvantifikovaní pomocou metódy ΔΔCt sa predpokladá rovnaká efektivita medzi cieľovými a referenčnými génmi (ideálne 100%). Keď sa efektivity významne líšia:
Nie, efektivitu by ste mali určiť pre každý pár primerov a mali by ste ju znovu validovať:
Inhibítory PCR môžu:
Termíny sa často používajú zameniteľne, ale:
Na zlepšenie efektivity qPCR:
Porovnávanie vzoriek s významne rôznymi efektivitami sa neodporúča, pretože:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE pokyny: minimálne informácie pre publikovanie experimentov kvantitatívneho real-time PCR. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Nový matematický model pre relatívne kvantifikovanie v real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Ako dobrý je odhad efektivity PCR: Odporúčania pre presné a robustné hodnotenia efektivity qPCR. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Konečný qPCR experiment: Produkovanie publikovateľných, reprodukovateľných údajov na prvýkrát. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Efektivita amplifikácie: prepojenie základnej línie a zaujatosti v analýze údajov kvantitatívneho PCR. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetická PCR analýza: real-time monitorovanie reakcií amplifikácie DNA. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Príručka aplikácií Real-Time PCR. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Príručka Real-Time PCR. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Náš qPCR Efektivita Kalkulátor poskytuje jednoduchý, ale mocný nástroj pre výskumníkov na validáciu a optimalizáciu ich kvantitatívnych PCR experimentov. Presným výpočtom efektivity zo štandardných kriviek môžete zabezpečiť spoľahlivé kvantifikovanie, riešiť problematické analýzy a dodržiavať osvedčené postupy v experimentovaní qPCR.
Vyskúšajte náš kalkulátor ešte dnes, aby ste zlepšili kvalitu a spoľahlivosť vašich qPCR údajov!
Objavte ďalšie nástroje, ktoré by mohli byť užitočné pre vašu pracovnú postupnosť