Kalkulačka ligácie DNA

Úvod

Ligácia DNA je kritická technika molekulárnej biológie používaná na spojenie fragmentov DNA s kovalentnými väzbami. Kalkulačka ligácie DNA je nevyhnutným nástrojom pre výskumníkov, ktorý pomáha určiť optimálne množstvá vektora a vloženia DNA potrebné na úspešné ligácie. Vypočítaním správnych molárnych pomerov medzi vektorom (plazmidom) a vloženými fragmentmi DNA táto kalkulačka zabezpečuje efektívne experimenty molekulárneho klonovania pri minimalizácii zbytočných činidiel a neúspešných reakcií.

Ligácie sú základom genetického inžinierstva, syntetickej biológie a procedúr molekulárneho klonovania. Umožňujú vedcom vytvárať rekombinantné DNA molekuly vložením génov záujmu do plazmidových vektorov na následnú transformáciu do hostiteľských organizmov. Úspech týchto reakcií závisí silne od použitia primeraných množstiev DNA komponentov, čo je presne to, čo táto kalkulačka pomáha určiť.

Či už konštruujete expresné vektory, vytvárate génové knižnice alebo vykonávate rutinné subklonovanie, táto kalkulačka ligácie DNA vám pomôže optimalizovať vaše experimentálne podmienky a zvýšiť vašu úspešnosť. Zadaním niekoľkých kľúčových parametrov o vašich vzorkách DNA môžete rýchlo získať presné objemy potrebné pre vašu konkrétnu ligáciu.

Formula/Vypočítanie

Kalkulačka ligácie DNA používa základnú molekulárnu biologickú formulu, ktorá zohľadňuje rôzne veľkosti a koncentrácie DNA fragmentov, ktoré sa spájajú. Hlavný výpočet určuje, koľko vloženej DNA je potrebné v pomere k vektorovej DNA na základe ich dĺžok a požadovaného molárneho pomeru.

Výpočet množstva vloženia

Množstvo potrebnej vloženej DNA (v nanogramoch) sa vypočíta pomocou nasledujúcej formuly:

$\text{ng vloženia} = \text{ng vektora} \times \frac{\text{kb veľkosť vloženia}}{\text{kb veľkosť vektora}} \times \text{molárny pomer}$

Kde:

• ng vektora = množstvo vektorovej DNA použitej v reakcii (typicky 50-100 ng)
• kb veľkosť vloženia = dĺžka vloženého fragmentu DNA v kilobázach (kb)
• kb veľkosť vektora = dĺžka vektorovej DNA v kilobázach (kb)
• molárny pomer = požadovaný pomer molekúl vloženia k molekulám vektora (typicky 3:1 až 5:1)

Výpočty objemu

Akonáhle je požadované množstvo vloženej DNA určené, objemy potrebné pre reakciu sa vypočítajú:

$\text{Objem vektora (μL)} = \frac{\text{ng vektora}}{\text{koncentrácia vektora (ng/μL)}}$

$\text{Objem vloženia (μL)} = \frac{\text{ng vloženia}}{\text{koncentrácia vloženia (ng/μL)}}$

$\text{Objem pufra/vody (μL)} = \text{Celkový objem reakcie (μL)} - \text{Objem vektora (μL)} - \text{Objem vloženia (μL)}$

Príklad výpočtu

Poďme si prejsť praktický príklad:

• Koncentrácia vektora: 50 ng/μL
• Dĺžka vektora: 3000 bp (3 kb)
• Koncentrácia vloženia: 25 ng/μL
• Dĺžka vloženia: 1000 bp (1 kb)
• Požadovaný molárny pomer (vloženie:vektor): 3:1
• Celkový objem reakcie: 20 μL
• Množstvo vektora, ktoré sa má použiť: 50 ng

Krok 1: Vypočítajte požadované množstvo vloženia $\text{ng vloženia} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Krok 2: Vypočítajte objemy $\text{Objem vektora} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Objem vloženia} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Objem pufra/vody} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Tento výpočet zabezpečuje, že v reakcii sú tri molekuly vloženia na každú molekulu vektora, čím sa optimalizujú šance na úspešnú ligáciu.

Podrobný návod na použitie kalkulačky

Naša kalkulačka ligácie DNA je navrhnutá tak, aby bola intuitívna a jednoduchá na použitie. Postupujte podľa týchto krokov na vypočítanie optimálnych objemov pre vašu ligáciu:

1. Zadajte informácie o vektore:

   • Zadajte koncentráciu vášho vektora v ng/μL
   • Zadajte dĺžku vektora v bázových pároch (bp)
   • Určte množstvo vektorovej DNA, ktoré chcete použiť v reakcii (ng)

2. Zadajte informácie o vložení:

   • Zadajte koncentráciu vašej vloženej DNA v ng/μL
   • Zadajte dĺžku vloženia v bázových pároch (bp)

3. Nastavte parametre reakcie:

   • Určte požadovaný molárny pomer (vloženie:vektor) - typicky medzi 3:1 a 5:1
   • Zadajte celkový objem reakcie v μL (zvyčajne 10-20 μL)

4. Zobrazte výsledky:

   • Kalkulačka automaticky zobrazí:
     • Požadovaný objem vektora (μL)
     • Požadovaný objem vloženia (μL)
     • Objem pufra/vody, ktorý je potrebné pridať (μL)
     • Celkový objem reakcie (μL)
     • Množstvo vektora a vloženia DNA v reakcii (ng)

5. Kopírovať výsledky (voliteľné):

   • Použite tlačidlo "Kopírovať výsledky" na skopírovanie všetkých výpočtov do schránky pre váš laboratórny denník alebo protokoly

Kalkulačka vykonáva validačné kontroly, aby zabezpečila, že všetky vstupy sú kladné čísla a že celkový objem je dostatočný pre požadované objemy DNA. Ak sa zistia akékoľvek chyby, užitočné chybové správy vás navedú na opravu vstupov.

Prípadové štúdie

Kalkulačka ligácie DNA je cenná v mnohých aplikáciách molekulárnej biológie:

Molekulárne klonovanie

Najbežnejším použitím je štandardné molekulárne klonovanie, kde vedci vkladajú gény alebo fragmenty DNA do plazmidových vektorov. Kalkulačka zabezpečuje optimálne podmienky pre:

• Subklonovanie génov medzi rôznymi expresnými vektormi
• Vytváranie fúznych proteínov spojením viacerých génových fragmentov
• Konštrukciu testovacieho génu
• Vytváranie plazmidových knižníc

Syntetická biológia

V syntetickej biológii, kde sa často zostavuje viacero DNA fragmentov:

• Reakcie Gibson Assembly ťažia z presných pomerov vloženia:vektora
• Systémy Golden Gate assembly vyžadujú špecifické koncentrácie DNA
• BioBrick assembly štandardizovaných genetických častí
• Konštrukcia syntetických genetických obvodov

Vývoj diagnostických súprav

Pri vývoji molekulárnych diagnostických nástrojov:

• Klonovanie genetických markerov špecifických pre ochorenia
• Konštrukcia pozitívnych kontrolných plazmidov
• Vývoj kalibračných štandardov pre qPCR

Systémy expresie proteínov

Pre výskumníkov pracujúcich na produkcii proteínov:

• Optimalizácia pomerov vloženia:vektor pre vysoko-kópiové expresné vektory
• Konštrukcia indukovateľných expresných systémov
• Vytváranie sekrečných vektorov pre purifikáciu proteínov

Aplikácie CRISPR-Cas9

V aplikáciách genómového editovania:

• Klonovanie sprievodných RNA do CRISPR vektorov
• Vytváranie darcovských šablón pre homológiu riadenej opravy
• Vytváranie knižníc sprievodných RNA na screening

Náročné ligácie

Kalkulačka je obzvlášť cenná pre náročné ligácie:

• Klonovanie veľkých vložení (>5 kb)
• Vkladanie veľmi malých fragmentov (<100 bp)
• Ligácie s tupými koncami, ktoré majú nižšiu účinnosť
• Reakcie na zostavenie viacerých fragmentov

Alternatívy

Hoci naša kalkulačka ligácie DNA poskytuje presné výpočty pre tradičné ligácie, existuje niekoľko alternatívnych prístupov na spojenie DNA fragmentov:

1. Gibson Assembly: Používa exonukleázu, polymerázu a ligázu v jednej reakcii v jednom skúmavke na spojenie prekryvných DNA fragmentov. Na tradičné výpočty ligácie nie je potrebný, ale pomery koncentrácií sú stále dôležité.

2. Golden Gate Assembly: Používa enzýmy typu IIS na smerovú, bezšvovú zostavu viacerých fragmentov. Vyžaduje ekvimolárne množstvá všetkých fragmentov.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Používa exonukleázu na vytvorenie jednovláknových prečnievaní, ktoré sa navzájom spájajú. Zvyčajne používa ekvimolárne pomery fragmentov.

4. In-Fusion Cloning: Komerčný systém, ktorý umožňuje spojenie fragmentov s 15 bp prekrytiami. Používa špecifický pomer založený na veľkostiach fragmentov.

5. Gateway Cloning: Používa špecifickú recombináciu namiesto ligácie. Vyžaduje špecifické vstupné a cieľové vektory.

6. Empirické testovanie: Niektoré laboratóriá dávajú prednosť nastaveniu viacerých ligácií s rôznymi pomermi vloženia:vektor (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) a určeniu, ktorý funguje najlepšie pre ich konkrétne konštrukty.

7. Softvérové kalkulačky: Komerčné softvérové balíčky ako Vector NTI a SnapGene obsahujú kalkulačky ligácie s ďalšími funkciami, ako je analýza restrikčných miest.

História

Vývoj výpočtov ligácie DNA paralelne s evolúciou techník molekulárneho klonovania, ktoré revolucionalizovali molekulárnu biológiu a biotechnológiu.

Ranné vývoj (1970. roky)

Koncept ligácie DNA pre molekulárne klonovanie sa objavil v raných 70. rokoch s priekopníckou prácou Paula Berga, Herberta Boyera a Stanleyho Cohena, ktorí vyvinuli prvé rekombinantné DNA molekuly. Počas tohto obdobia boli ligácie do značnej miery empirické, pričom výskumníci používali pokusy a omyly na určenie optimálnych podmienok.

Objav restrikčných enzýmov a DNA ligázy poskytol základné nástroje na rezanie a znovu spájanie DNA molekúl. T4 DNA ligáza, izolovaná z T4 bakteriofágom infikovaných E. coli, sa stala štandardným enzýmom na spojenie DNA fragmentov vďaka svojej schopnosti ligovať ako tupé, tak aj koherentné konce.

Obdobie zdokonaľovania (1980. - 1990. roky)

Ako sa molekulárne klonovanie stalo bežnejším, výskumníci začali vyvíjať systematickejšie prístupy k ligáciám. Dôležitosť molárnych pomerov medzi vektorom a vložením DNA sa ukázala ako zjavná, čo viedlo k vývoju základnej formuly, ktorá sa stále používa dnes.

Počas tohto obdobia výskumníci zistili, že nadbytok vloženej DNA (typicky 3:1 až 5:1 molárny pomer vloženia k vektoru) zvyčajne zlepšuje účinnosť ligácie pre štandardné klonovacie aplikácie. Tieto poznatky sa pôvodne zdieľali prostredníctvom laboratórnych protokolov a postupne sa dostali do manuálov a učebníc molekulárnej biológie.

Moderná éra (2000. - súčasnosť)

Vznik výpočtových nástrojov a online kalkulačiek v 2000. rokoch urobil presné výpočty ligácie dostupnejšie pre výskumníkov. Ako sa techniky molekulárnej biológie stávali sofistikovanejšími, potreba presných výpočtov sa stala kritickejšou, najmä pre náročné klonovacie projekty zahŕňajúce viaceré fragmenty alebo veľké vloženia.

Dnes sú výpočty ligácie DNA integrálnou súčasťou pracovných tokov molekulárneho klonovania, pričom špeciálne kalkulačky ako táto pomáhajú výskumníkom optimalizovať ich experimenty. Základná formula zostala väčšinou nezmenená, hoci naše porozumenie faktorom ovplyvňujúcim účinnosť ligácie sa zlepšilo.

Vznik alternatívnych metód klonovania, ako je Gibson Assembly a Golden Gate klonovanie, zaviedol nové potreby výpočtu, ale základný koncept molárnych pomerov medzi DNA fragmentmi zostáva dôležitý naprieč týmito technikami.

Príklady kódu

Tu sú implementácie kalkulačky ligácie DNA v rôznych programovacích jazykoch:

1' Excel VBA Funkcia pre kalkulačku ligácie DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Vypočítajte požadované množstvo vloženia v ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Vypočítajte objem vektora v μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Vypočítajte objem vloženia v μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Vypočítajte objem pufra/vody v μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Príklad použitia v bunke:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Vypočítajte objemy pre reakciu ligácie DNA.
5    
6    Parametre:
7    vector_concentration (float): Koncentrácia vektorovej DNA v ng/μL
8    vector_length (float): Dĺžka vektorovej DNA v bázových pároch
9    insert_concentration (float): Koncentrácia vloženej DNA v ng/μL
10    insert_length (float): Dĺžka vloženia v bázových pároch
11    molar_ratio (float): Požadovaný molárny pomer vloženia:vektor
12    total_volume (float): Celkový objem reakcie v μL
13    vector_amount (float): Množstvo vektorovej DNA, ktoré sa má použiť v ng (predvolené: 50)
14    
15    Návrat:
16    dict: Slovník obsahujúci vypočítané objemy a množstvá
17    """
18    # Vypočítajte objem vektora
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Vypočítajte požadované množstvo vloženia
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Vypočítajte objem vloženia
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Vypočítajte objem pufra/vody
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Príklad použitia
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Vloženie: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Pufor: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Celkom: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Preveďte dĺžky na kb pre výpočet
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Vypočítajte požadované množstvo vloženia
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Vypočítajte objemy
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Príklad použitia
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Vloženie: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Pufor: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Celkom: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Preveďte dĺžky na kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Vypočítajte požadované množstvo vloženia
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Vypočítajte objemy
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Zaokrúhľte na 2 desatinné miesta
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Vloženie: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Pufor: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Celkom: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Preveďte dĺžky na kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Vypočítajte požadované množstvo vloženia
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Vypočítajte objemy
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Zaokrúhľte na 2 desatinné miesta
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Vloženie: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Pufor: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Celkom: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Často kladené otázky (FAQ)

Aký je optimálny molárny pomer pre ligáciu DNA?

Optimálny molárny pomer vloženia k vektoru sa typicky pohybuje medzi 3:1 a 5:1 pre štandardné ligácie. Avšak, to sa môže líšiť v závislosti od konkrétneho scenára ligácie:

• Pre ligácie s koherentnými koncami: 3:1 až 5:1
• Pre ligácie s tupými koncami: 1:1 až 3:1
• Pre veľké vloženia (>10 kb): 1:1 až 2:1
• Pre malé vloženia (<500 bp): 5:1 až 10:1
• Pre zostavenie viacerých fragmentov: 3:1 pre každý vložený fragment k vektoru

Prečo moja ligácia zlyháva, aj keď používam vypočítané objemy?

Na účinnosť ligácie môže vplývať niekoľko faktorov nad rámec molárneho pomeru:

1. Kvalita DNA: Uistite sa, že vektor aj vloženie majú čisté konce bez poškodenia
2. Defoforizácia: Skontrolujte, či bol váš vektor defosforylovaný, čo zabraňuje samoligácii
3. Aktivita enzýmu: Overte, či je vaša ligáza aktívna a použitá pri správnej teplote
4. Čas inkubácie: Niektoré ligácie profitujú z dlhšej inkubácie (cez noc pri 16 °C)
5. Podmienky pufra: Uistite sa, že sa používa správny pufor s ATP
6. Kontaminanty: Purifikujte DNA, aby ste odstránili inhibítory ako EDTA alebo vysokú soľ

Koľko vektorovej DNA by som mal použiť v reakcii ligácie?

Typicky sa odporúča 50-100 ng vektorovej DNA pre štandardné ligácie. Použitie príliš veľkého množstva vektora môže viesť k vyššiemu pozadiu neorezaného alebo samoligovaného vektora, zatiaľ čo príliš malé množstvo môže znížiť účinnosť transformácie. Pre náročné ligácie môže byť potrebné optimalizovať toto množstvo.

Mal by som upraviť výpočty pre ligácie s tupými koncami v porovnaní s koherentnými koncami?

Áno. Ligácie s tupými koncami sú zvyčajne menej účinné ako ligácie s koherentnými koncami. Pre ligácie s tupými koncami používajte:

• Vyššie molárne pomery (3:1 až 5:1 alebo aj vyššie)
• Viac T4 DNA ligázy (typicky 2-3 krát viac)
• Dlhšie časy inkubácie
• Zvážte pridanie PEG na zvýšenie účinnosti ligácie

Ako vypočítam ligáciu pre viaceré vloženia?

Pre zostavenie viacerých fragmentov:

1. Vypočítajte každé množstvo vloženia individuálne pomocou rovnakej formuly
2. Udržujte rovnaký celkový molárny pomer (napr. pre dva vloženia, použite 1.5:1.5:1 vloženie1:vložení2:vektor)
3. Upravte celkový objem reakcie, aby ste sa prispôsobili všetkým fragmentom DNA
4. Zvážte sekvenčnú ligáciu alebo použitie metód zostavovania ako Gibson Assembly pre viaceré fragmenty

Môžem použiť túto kalkulačku pre Gibson Assembly alebo Golden Gate Assembly?

Táto kalkulačka je špeciálne navrhnutá pre tradičné klonovacie reakcie založené na restrikčných enzýmoch a ligáze. Pre Gibson Assembly sa typicky odporúčajú ekvimolárne množstvá všetkých fragmentov (1:1 pomer), hoci základný výpočet množstva DNA na základe dĺžky je podobný. Pre Golden Gate Assembly sa tiež obvykle používajú ekvimolárne pomery všetkých komponentov.

Ako mám zohľadniť dephosphoryláciu vektora vo svojich výpočtoch?

Dephosphorylácia vektora (odstránenie 5' fosfátových skupín) zabraňuje samoligácii, ale nemení výpočty množstva. Avšak, pre dephosphorylované vektory:

1. Použite čerstvú vloženú DNA s intaktnými 5' fosfátmi
2. Zvážte použitie mierne vyšších pomerov vloženia:vektor (4:1 až 6:1)
3. Uistite sa o dlhších časoch ligácie (aspoň 1 hodina pri izbovej teplote alebo cez noc pri 16 °C)

Aký je minimálny celkový objem reakcie, ktorý by som mal použiť?

Minimálny praktický objem reakcie je typicky 10 μL, čo umožňuje adekvátne miešanie a zabraňuje problémom s odparovaním. Ak vaše vypočítané objemy DNA presahujú požadovaný objem reakcie, máte niekoľko možností:

1. Použite koncentrovanejšie vzorky DNA
2. Znížte množstvo použitého vektora (napr. 25 ng namiesto 50 ng)
3. Zvýšte celkový objem reakcie
4. Zvážte koncentráciu vašich vzoriek DNA

Ako dlho by som mal inkubovať svoju ligáciu?

Optimálne časy inkubácie sa líšia v závislosti od typu ligácie:

• Ligácie s koherentnými koncami: 1 hodina pri izbovej teplote (22-25 °C) alebo 4-16 hodín pri 16 °C
• Ligácie s tupými koncami: 2-4 hodiny pri izbovej teplote alebo cez noc (12-16 hodín) pri 16 °C
• Rýchle ligácie (používajúce vysoko-koncentrovanú ligázu): 5-15 minút pri izbovej teplote

Môžem znovu použiť zvyšok ligácie na transformáciu?

Áno, zmesi ligácie sa zvyčajne môžu skladovať pri -20 °C a znovu použiť na transformáciu. Avšak, každé cyklus zamrznutia a rozmrazenia môže znížiť účinnosť. Pre najlepšie výsledky:

1. Rozdeľte zmes ligácie pred zamrazením
2. Teplom inaktivujte ligázu (65 °C po dobu 10 minút) pred skladovaním
3. Použite do 1-2 mesiacov pre optimálne výsledky

Odkazy

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molekulárne klonovanie: Laboratórny manuál (3. vydanie). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molekulárne klonovanie: Laboratórny manuál (4. vydanie). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). Metóda presnej zostavy DNA s vysokou priepustnosťou v jednom kroku. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatická zostava DNA molekúl až do niekoľkých stoviek kilobáz. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Klonovanie nezávislé od ligácie PCR produktov (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Makromolekulárne preplnenie umožňuje ligáciu tupých koncov DNA ligázami z pečene potkana alebo Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Referenčný materiál molekulárnej biológie. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - Protokol ligácie DNA. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Technický referenčný materiál molekulárneho klonovania. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Technický manuál klonovania. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/