Kalkulačka ligácie DNA - Výpočet pomeru Insert:Vektor pre molekulárne klonovanie

Ligácia DNA je krok molekulárneho klonovania, pri ktorom sa fragment vložky spája s plazmidovým vektorom pomocou enzýmu T4 DNA ligázy. Kalkulačka ligácie DNA vypočíta, koľko mikrolitrov DNA vložky a vektorovej DNA treba zmiešať, aby reakcia dosiahla zvolený molárny pomer vložky k vektoru.

Čo kalkulačka robí

Kalkulačka používa šesť vstupných údajov: koncentráciu vektora, dĺžku vektora, koncentráciu vložky, dĺžku vložky, cieľový molárny pomer vložky k vektoru a celkový objem reakcie. Umožňuje tiež nastaviť množstvo použitej vektorovej DNA, ktorého predvolená hodnota je 50 nanogramov (ng). Z týchto hodnôt vypočíta objem vektora na napipetovanie, objem vložky na napipetovanie a množstvo pufra alebo vody, ktoré treba pridať na dosiahnutie celkového objemu reakcie.

Koncentrácia sa meria v nanogramoch na mikroliter (ng/μL), zvyčajne pomocou prístroja Nanodrop alebo Qubit. Dĺžka sa meria v pároch báz (bp). Jedna kilobáza (kb) zodpovedá 1000 párom báz. Molárny pomer opisuje, koľko molekúl vložky má pripadať na jednu molekulu vektora. Nejde o pomer hmotností.

Prečo sa používa molárny pomer, a nie hmotnosť

Rovnaké hmotnosti DNA neobsahujú rovnaký počet molekúl. Krátka vložka váži menej než dlhý vektor pri rovnakom počte molekúl. Zmiešaním rovnakého množstva krátkej vložky a dlhého vektora v nanogramoch by vzniklo príliš málo molekúl vložky v pomere k molekulám vektora. Kalkulačka upravuje hmotnosť vložky podľa pomeru dĺžok fragmentov, aby výsledná zmes obsahovala zamýšľaný počet molekúl vložky na jednu molekulu vektora.

Vzorec ligácie DNA

Potrebné množstvo DNA vložky v nanogramoch je:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

kde $m_i$ je množstvo vložky v nanogramoch, $m_v$ množstvo vektora v nanogramoch, $k_i$ dĺžka vložky v kilobázových pároch, $k_v$ dĺžka vektora v kilobázových pároch a R cieľový molárny pomer vložky k vektoru.

Po určení tohto množstva kalkulačka premení každé množstvo na objem, ktorý možno napipetovať:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

kde $V_v$ a $V_i$ sú objemy vektora a vložky v mikrolitroch, $c_v$ a $c_i$ sú koncentrácie vektora a vložky v nanogramoch na mikroliter, $V_b$ je objem pufra a $V_t$ celkový objem reakcie.

Ak je súčet objemov vektora a vložky väčší než celkový objem reakcie, nezostáva priestor na pufer, ligázu ani vodu. V takom prípade kalkulačka oznámi, že celkový objem je príliš malý, namiesto zobrazenia záporného objemu pufra.

Vyriešený príklad

Výskumník klonuje génový fragment s dĺžkou 1 kb do plazmidového vektora s dĺžkou 3 kb. Plánuje použiť 50 ng vektorovej DNA pri molárnom pomere vložky k vektoru 3:1 v reakcii s objemom 20 μL.

Vstupné údaje:

• Koncentrácia vektora: 50 ng/μL
• Dĺžka vektora: 3000 bp (3 kb)
• Koncentrácia vložky: 25 ng/μL
• Dĺžka vložky: 1000 bp (1 kb)
• Molárny pomer: 3
• Celkový objem: 20 μL
• Množstvo vektora: 50 ng

Krok 1: množstvo vložky

Množstvo vložky v ng = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Krok 2: objemy

Objem vektora = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Objem vložky = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Objem pufra = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakcia pozostáva z 1 μL vektora, 2 μL vložky a 17 μL pufra alebo vody, kam sa pridáva aj ligáza a jej reakčný pufer. Táto zmes obsahuje tri molekuly vložky na každú molekulu vektora.

Typické molárne pomery pri ligácii

Pri väčšine štandardných klonovaní s lepkavými previsnutými koncami sa používa pomer vložky k vektoru 3:1. Ligácie spájajúce tupé konce sú menej účinné, preto je bežný vyšší pomer, napríklad 5:1. Pri veľmi veľkých vložkách niekedy lepšie funguje nižší pomer, približne 1:1, pretože veľké fragmenty už obsahujú veľa párov báz na jednu molekulu.

Najčastejšie otázky

Čo je ligácia DNA?

Ligácia DNA je spojenie dvoch fragmentov DNA, zvyčajne plazmidového vektora a vložky, do jednej súvislej molekuly. Enzým T4 DNA ligáza utesňuje spojenie medzi koncami fragmentov.

Čo znamená molárny pomer vložky k vektoru?

Ide o počet molekúl DNA vložky prítomných na jednu molekulu vektora v reakcii. Pomer 3:1 znamená tri molekuly vložky na každú molekulu vektora bez ohľadu na porovnanie ich hmotností.

Prečo nepoužiť rovnaké množstvá vektora a vložky v nanogramoch?

Fragmenty DNA s rozdielnou dĺžkou majú rozdielnu hmotnosť na jednu molekulu. Vložka s dĺžkou 1 kb váži približne tretinu hmotnosti vektora s dĺžkou 3 kb, ak porovnáme jednotlivé molekuly. Rovnaké množstvá každého fragmentu v nanogramoch by neposkytli rovnaký počet molekúl, preto kalkulačka upravuje hmotnosť vložky tak, aby zodpovedala cieľovému molárnemu pomeru.

Čo znamená, ak je celkový objem príliš malý?

Znamená to, že samotné objemy vektora a vložky už spotrebujú celý objem reakcie a nezostáva priestor na pufer alebo ligázu. Riešením je zväčšiť celkový objem reakcie alebo použiť koncentrovanejšie zásobné roztoky DNA.

Dá sa táto kalkulačka použiť na klonovanie Gibson Assembly alebo Golden Gate?

Nie. Tieto metódy používajú inú reakčnú chémiu a zvyčajne cielia na ekvimolárne množstvá všetkých fragmentov, nie na pevný pomer vložky k vektoru. Výpočty objemov sa líšia od štandardného klonovania s T4 ligázou.

Aké množstvo vektorovej DNA sa zvyčajne používa?

50 ng je bežné východiskové množstvo pre štandardnú ligáciu. Laboratóriá používajú aj množstvá od 25 do 100 ng, upravené podľa koncentrácie DNA a rozsahu reakcie.