Kalkulator temperature prileganja DNA | Brezplačno orodje za Tm PCR

Kaj je kalkulator temperature prileganja začetnih oligonukleotidov DNA?

Kalkulator temperature prileganja DNA oceni temperaturo taljenja (Tm) začetnega oligonukleotida iz njegovega zaporedja. Tm je temperatura, pri kateri je polovica molekul začetnega oligonukleotida vezana na ciljno verigo, polovica pa ne. Pri verižni reakciji s polimerazo (PCR) ta vrednost določa temperaturo, pri kateri se začetni oligonukleotidi vežejo na matrico DNA.

Zakaj je temperatura prileganja pomembna pri PCR

PCR kopira ciljni odsek DNA s ponavljajočimi se cikli segrevanja in ohlajanja. Vsak cikel ima tri korake. Najprej segrevanje pri približno 95 °C loči dvovijačno matrico. Ta korak se imenuje denaturacija. Nato se reakcija ohladi na temperaturo prileganja, običajno med 50 °C in 65 °C, da se lahko kratki začetni oligonukleotidi vežejo na komplementarna zaporedja enoverižnih molekul. V tretjem koraku se temperatura dvigne na približno 72 °C, encim, imenovan DNA-polimeraza, pa podaljša začetne oligonukleotide in tako zgradi nove verige DNA.

Če je temperatura prileganja prenizka, se začetni oligonukleotidi vežejo na zaporedja, ki se ujemajo le delno, zato nastanejo dodatni neželeni fragmenti DNA. Če je previsoka, začetni oligonukleotidi ne morejo tvoriti stabilne vezi z matrico, zato se kopira malo DNA ali pa se ta sploh ne kopira. Temperatura prileganja je ena prvih nastavitev, ki jih raziskovalci prilagodijo, kadar PCR-reakcija ne uspe.

Kako vsebnost GC vpliva na Tm

Začetni oligonukleotid se s svojo ciljno sekvenco povezuje z vodikovimi vezmi. Par gvanin-citozin (G-C) tvori tri vodikove vezi. Par adenin-timin (A-T) tvori dve. Za ločitev začetnega oligonukleotida z več bazami G in C je potrebne več toplote, zato ima višji Tm kot enako dolg začetni oligonukleotid z več bazami A in T. Vsebnost GC se običajno zapiše kot odstotek: število baz G in C, deljeno s skupno dolžino zaporedja, krat 100.

Formula za temperaturo prileganja DNA

Ta kalkulator uporablja eno od dveh formul, izbrano glede na dolžino začetnega oligonukleotida.

Za začetne oligonukleotide z 14 nukleotidi ali več uporablja formulo Marmur-Doty za vsebnost GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

N_GC je število baz G in C v začetnem oligonukleotidu, prešteto neposredno in ne izraženo kot odstotek. N je skupno število baz.

Za začetne oligonukleotide, krajše od 14 nukleotidov, uporablja Wallaceovo pravilo:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G in C predstavljajo število posamezne baze v začetnem oligonukleotidu.

Obe formuli predpostavljata običajne pogoje PCR: približno 50 nanomolarnega začetnega oligonukleotida in 50 milimolarnega Na+.

Rešen primer

Vzemimo začetni oligonukleotid z 19 bazami: ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Njegova dolžina je 19, kar je 14 ali več, zato kalkulator uporabi formulo Marmur-Doty.

• Dolžina (N) = 19
• Število G = 5, število C = 5, zato je N_GC = 10, vsebnost GC pa je 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formula uporablja število GC, 10, ne odstotka GC, 52,6. Če pomotoma uporabimo odstotek, dobimo Tm blizu 143 °C, kar ni realna vrednost za PCR-reakcijo, ki poteka med 50 °C in 95 °C.

Kako uporabljati ta kalkulator

Vnesite ali prilepite zaporedje začetnega oligonukleotida, sestavljeno samo iz črk A, T, G in C. Kalkulator prikaže dolžino zaporedja v nukleotidih (nt), vsebnost GC kot odstotek in izračunano temperaturo prileganja v stopinjah Celzija. Rezultat lahko kopirate v laboratorijske zapiske ali protokol.

Izbira temperature prileganja pri PCR

Tm je izračunana ocena, ne zagotovljena delovna temperatura. Številni protokoli začnejo dejanski korak prileganja nekaj stopinj pod izračunanim Tm, nato pa temperaturo prilagodijo glede na rezultat na gelu. Pri paru začetnih oligonukleotidov se kot začetna točka običajno uporabi nižja od njunih vrednosti Tm. Gradientni PCR, pri katerem hkrati poteka več reakcij v območju različnih temperatur, je pogost način iskanja najboljše temperature s preizkušanjem.

Drugi načini ocenjevanja Tm

Tukaj uporabljeni formuli Marmur-Doty in Wallace sta hitri približki, ki temeljita samo na sestavi baz. Obstajajo tudi druge metode:

• Termodinamika najbližjih sosedov upošteva, kako vsak par sosednjih baz vpliva na stabilnost, in velja za natančnejšo metodo pri standardnih začetnih oligonukleotidih.
• Formule s korekcijo glede na koncentracijo soli dodajo popravek za koncentracijo ionov Na+ ali K+ v reakcijskem pufru, saj višja koncentracija soli stabilizira dvoverižno DNA in zviša Tm.

Različni kalkulatorji lahko za isti začetni oligonukleotid prikažejo različne vrednosti Tm, ker uporabljajo različne formule. Končni preizkus je še vedno izvedba PCR in preverjanje rezultata.

Pogosta vprašanja

Kaj je temperatura prileganja DNA?

To je temperatura, pri kateri se začetni oligonukleotidi DNA med PCR vežejo na komplementarno zaporedje na matrični verigi. V laboratorijih jo običajno nastavijo nekaj stopinj pod izračunano temperaturo taljenja (Tm) začetnega oligonukleotida.

Kako se izračuna Tm začetnega oligonukleotida?

Za začetne oligonukleotide z 14 bazami ali več je Tm = 64,9 + 41 × (število GC − 16,4) / dolžina. Za začetne oligonukleotide, krajše od 14 baz, je Tm = 2 × (število A+T) + 4 × (število G+C).

Zakaj vsebnost GC zviša Tm?

Pari baz G-C tvorijo tri vodikove vezi, pari A-T pa dve. Za ločitev začetnega oligonukleotida z večjim deležem baz G in C od njegove ciljne sekvence je potrebne več energije in zato višja temperatura.

Ali mora biti temperatura prileganja pri PCR enaka izračunanemu Tm?

Ne. Večina protokolov začne nekaj stopinj pod izračunanim Tm in nato temperaturo prilagodi, ker Tm označuje točko, pri kateri je vezana le polovica začetnega oligonukleotida.

Ali dolžina začetnega oligonukleotida spremeni Tm?

Da, vendar ne na preprost način. Dolžina je v imenovalcu formule Marmur-Doty, zato daljši začetni oligonukleotid s povprečno vsebnostjo GC nima samodejno višjega Tm kot krajši začetni oligonukleotid z veliko GC.

Zakaj se različni kalkulatorji Tm ne ujemajo?

Uporabljajo različne formule. Wallaceovo pravilo, formula Marmur-Doty za vsebnost GC, termodinamika najbližjih sosedov in formule s korekcijo glede na koncentracijo soli lahko za isti začetni oligonukleotid dajo različne vrednosti Tm, včasih za več stopinj.

Viri

1. Marmur J, Doty P. Določanje sestave baz deoksiribonukleinske kisline iz njene temperature toplotne denaturacije. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hibridizacija sintetičnih oligodeoksiribonukleotidov z DNA phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J ml. Enoten pogled na termodinamiko najbližjih sosedov polimerov, DNA v obliki uteži in oligonukleotidov. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.