Kalkulator encimske aktivnosti - Michaelis-Mentenova kinetika

Kalkulator encimske aktivnosti

Kalkulator encimske aktivnosti ugotovi, kako hitro encim pretvori substrat v produkt, izraženo kot specifična aktivnost v enotah na miligram (U/mg). Uporablja enačbo Michaelisa in Mentenove, standardni model za encimsko kinetiko, skupaj s količino encimskih beljakovin v vzorcu.

Encimi so beljakovine, ki pospešujejo kemijske reakcije v celicah, ne da bi se pri tem porabile. Znanstveniki merijo aktivnost encima, da primerjajo različne serije, preverijo, ali je bil korak čiščenja uspešen, ali preskusijo, kako zdravilo vpliva na hitrost encima. Sama številka za koncentracijo encima ne pove, ali encim opravlja svojo nalogo. To pokaže specifična aktivnost.

Kaj izračuna kalkulator

Orodje uporablja pet vnosov: koncentracijo encima, koncentracijo substrata, Michaelisovo konstanto (Km), največjo hitrost (Vmax) in čas reakcije. Čas reakcije se zabeleži za referenco, vendar ne vstopa v formulo. Vmax je že hitrost, torej količina substrata, pretvorjena na minuto, zato je čas že vključen vanjo. Ponovno deljenje s časom bi ga upoštevalo dvakrat.

Kalkulator vrne eno številčno vrednost in en graf:

• Specifična aktivnost, v U/mg. To je hitrost reakcije, deljena s količino prisotnih encimskih beljakovin.
• Graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata, ki prikazuje nizki, prehodni in nasičeni del krivulje. Na njem je označena hitrost pri vneseni koncentraciji substrata.

Kako izračunati encimsko aktivnost

Michaelis-Mentenova enačba

Leonor Michaelis in Maud Menten sta ta model objavila leta 1913. Opisuje, kako je hitrost reakcije encima odvisna od koncentracije substrata:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = hitrost reakcije pri dani koncentraciji substrata
• $V_{max}$ = največja hitrost, hitrost, ko je encim popolnoma nasičen s substratom
• $[S]$ = koncentracija substrata
• $K_m$ = Michaelisova konstanta: koncentracija substrata, pri kateri je hitrost polovica Vmax

Formula za specifično aktivnost

Specifična aktivnost je ta hitrost, deljena s količino prisotnih encimskih beljakovin, rezultat pa je izražen v enotah na miligram (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Pri tem je $A$ specifična aktivnost, $[E]$ pa koncentracija encima.

Ena encimska enota (U) je količina encima, ki na minuto pretvori 1 mikromol (µmol) substrata. To definicijo je določila Mednarodna zveza za biokemijo in molekularno biologijo (IUBMB).

Enote se izidejo takole. V enačbi Michaelisa in Mentenove ima hitrost enote koncentracije substrata, deljene s časom. Kalkulator uporablja [S] in Km v mM, zato sta Vmax in v izražena v µmol na minuto na mililiter, zapisano µmol/(min·mL). To je enako kot mM/min in tudi kot U/mL. Koncentracija encima [E] je v mg/mL. Pri deljenju se mililitri pokrajšajo:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax že vsebuje »na minuto«, zato v formuli ni ločenega člena za čas.

Ta izračun predpostavlja, da je izmerjena hitrost začetna hitrost, določena na začetku reakcije, preden začne primanjkovati substrata ali produkt zavirati encim. V laboratorijih običajno merijo prvih 5–10% pretvorjenega substrata, da ostanejo v tem linearnem območju.

Rešen primer

Primer 1. Koncentracija encima je 1 mg/mL, koncentracija substrata 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). To so vrednosti, s katerimi kalkulator začne.

Hitrost = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Specifična aktivnost = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Primer 2. Enaki pogoji, vendar je koncentracija encima podvojena na 2 mg/mL.

Hitrost = 33,33 µmol/(min·mL), nespremenjena, saj hitrost v tej enačbi ni odvisna od [E]. Specifična aktivnost = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Podvojitev količine encima prepolovi specifično aktivnost, ker je ista skupna hitrost zdaj porazdeljena med dvakrat več beljakovin.

Primer 3. Substrat je povečan na 100 mM, kar je precej nad Km, koncentracija encima pa je 1 mg/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL).

Hitrost = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Specifična aktivnost = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Pri visoki koncentraciji substrata je encim skoraj nasičen, zato je hitrost blizu Vmax.

Primer 4. Substrat je zmanjšan na 1 mM, kar je pod Km, koncentracija encima pa je 1 mg/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL).

Hitrost = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Specifična aktivnost = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Pod Km majhna količina substrata omejuje reakcijo, zato sta hitrost in specifična aktivnost precej manjši od Vmax.

Pojasnjeni ključni parametri

Koncentracija encima [E] je masa encimskih beljakovin na prostornino, izražena v mg/mL. Višja vrednost porazdeli isto hitrost reakcije med več beljakovin, zato zniža specifično aktivnost. Specifična aktivnost, ne sama koncentracija, pokaže, ali encimski pripravek dobro deluje.

Koncentracija substrata [S] je količina substrata, ki je encimu na voljo za delovanje, običajno izražena v mM. Pri nizki [S] majhna povečanja močno zvišajo hitrost. Blizu nasičenja dodatni substrat le malo pomaga.

Michaelisova konstanta (Km) je koncentracija substrata, pri kateri je hitrost enaka polovici Vmax. Nizek Km pomeni, da encim doseže polovico največje hitrosti pri nizki koncentraciji substrata, kar kaže na močno vezavo med encimom in substratom. Heksokinaza ima na primer Km za glukozo približno 0,1 mM, kar kaže na visoko afiniteto.

Največja hitrost (Vmax) je hitrost, ko substrat ni več omejujoč dejavnik. Vnesite jo v µmol/(min·mL), kar je enako kot mM/min ali U/mL, da se ujema z enotami mM za [S] in Km. Odvisna je od količine prisotnega encima in od tega, kako hitro lahko posamezna molekula encima pretvarja substrat (njeno katalitsko število, kcat).

Čas reakcije je čas trajanja testa. Pomaga pri načrtovanju poskusa, saj lahko predolgo trajajoča reakcija izčrpa substrat in se preneha obnašati linearno. Sam po sebi ni del formule za specifično aktivnost.

Branje krivulje hitrosti

Graf prikazuje hitrost v odvisnosti od koncentracije substrata z uporabo enačbe Michaelisa in Mentenove.

• Pod Km: hitrost narašča približno sorazmerno s substratom. Majhne napake v koncentraciji substrata povzročijo velike napake v rezultatu.
• Blizu Km: krivulja se ukrivi. Hitrost je polovica Vmax.
• Nad Km: krivulja se izravna. Dodatni substrat le malo poveča hitrost, ker je encim skoraj nasičen.

Zakaj je specifična aktivnost pomembna

Specifična aktivnost je standardno merilo čistosti in kakovosti encima. Med čiščenjem jo znanstveniki spremljajo pri vsakem koraku: surov celični ekstrakt lahko pokaže nekaj U/mg, zelo prečiščen vzorec pa lahko doseže stotine ali tisoče U/mg. Naraščanje specifične aktivnosti med postopkom čiščenja kaže, da se neaktivne beljakovine odstranjujejo, medtem ko se želeni encim ohranja.

Ista meritev podpira odkrivanje zdravil, pri katerem raziskovalci preverjajo, kako kandidatske spojine zmanjšujejo aktivnost encima, in klinično diagnostiko, pri kateri zdravniki v krvi merijo encime, kot sta ALT in AST, da preverijo poškodbe jeter.

Pogosta vprašanja

Kako izračunate encimsko aktivnost iz Km in Vmax? Najprej z enačbo Michaelisa in Mentenove izračunajte hitrost reakcije, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Nato jo delite s koncentracijo encima, da dobite specifično aktivnost v U/mg: Aktivnost = v / [E]. Vmax naj bo v µmol/(min·mL), [E] pa v mg/mL, da se enote pokrajšajo na U/mg.

Kaj je enota (U) encimske aktivnosti? Ena enota je količina encima, ki v navedenih pogojih na minuto pretvori 1 µmol substrata, kot določa IUBMB.

Zakaj formula ne vključuje časa reakcije? Vmax je že izražen kot količina na minuto, zato je hitrost in ne skupna količina. Ponovno deljenje s časom bi ga upoštevalo dvakrat in povzročilo, da bi bil rezultat odvisen od trajanja testa, kar se pri lastnosti samega encima ne bi smelo zgoditi.

Zakaj specifična aktivnost upade, ko se poveča koncentracija encima? Hitrost v enačbi Michaelisa in Mentenove ni odvisna od koncentracije encima. Specifična aktivnost to stalno hitrost deli z [E], zato večji [E] pomeni manjši rezultat. Encimske pripravke z različnimi koncentracijami pošteno primerjamo s specifično aktivnostjo, ne s samo hitrostjo.

Kaj pomeni nizek Km? Nizek Km pomeni, da encim doseže polovico največje hitrosti pri nizki koncentraciji substrata, kar kaže, da se encim in substrat močno vežeta.

Ali je lahko specifična aktivnost negativna? Ne. Negativen rezultat kaže na napako pri vnosu, na primer negativno koncentracijo, ali na računsko napako, ne pa na dejansko meritev encima.

Viri

1. Michaelis, L., in Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., in Stryer, L. (2012). Biochemistry (7. izd.). W.H. Freeman and Company.
3. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA Enzyme Database. https://www.brenda-enzymes.org/